本文關(guān)鍵詞： 幽門螺桿菌 Tim Th免疫反應 疫苗　出處：《南昌大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 背景和目的: 機體的免疫反應在幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)致病和H. pylori疫苗的免疫保護中均起重要作用,因此闡明H. pylori感染的免疫致病機制和H. pylori疫苗的免疫保護機制,對于H. pylori相關(guān)性疾病的防治具有十分重要的意義。Th免疫反應在H. pylori感染的免疫致病及疫苗的免疫保護中均起著重要作用。但是H. pylori感染和H. pylori疫苗接種究竟通過何種機制影響Th反應,目前尚不清楚。T細胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule,Tim)是新近發(fā)現(xiàn)在T細胞表面的跨膜蛋白家族,它對CD4+T細胞分化成Th1和Th2細胞,調(diào)控效應T細胞(Th1和Th2)的應答起著重要作用,Tim-1和Tim-3是Tim家族中的兩個重要成員,它們分別在分化成熟的Th2和Th1細胞表達,并參與Th免疫反應的調(diào)控。H. pylori感染及疫苗接種對Tim的影響目前尚不清楚,為此本研究在體內(nèi)外觀察了H. pylori感染及疫苗接種后Tim-1及Tim-3的表達,及其與Th1和Th2免疫反應的關(guān)系,旨在初步探討H. pylori感染和H. pylori疫苗接種影響Th反應的機制,為后續(xù)以Tim-1和Tim-3為靶點防治H. pylori感染和H. pylori相關(guān)性疾病提供理論和實驗依據(jù)。 方法: (1) H. pylori與小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng):以不同濃度的SS1 H. pylori活菌(0 CFU/ml、0.50×10~7CFU/ml、1.00×10~7CFU/ml、2.00×10~7CFU/ml、4.00×10~7CFU/ml)與原代分離的BALB/c小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng),分別在3h、6h、12h和24h點收集細胞。 (2)小鼠H. pylori感染模型建立和根除治療:6-8周齡的清潔級的BALB/c小鼠,給予含1.0×10~9/ml的SS1 H. pylori活菌液,0.5ml/只,灌胃,隔日一次,共5次。建立動物模型后,隨機分為2組:H. pylori感染組:僅給予藥物賦形劑5%阿拉伯樹膠溶液;H. pylori根除組:給予洛賽克(質(zhì)子泵抑制劑,PPI)0.06 mg/次/只,羥氨芐青霉素2.9mg/次/只,克拉霉素1.5 mg/次/只和5%阿拉伯樹膠溶液。分別給予上述藥物每日2次灌胃,共2周。另設(shè)一正常對照組不給予H. pylori和任何藥物。停藥后4周,處死小鼠,取標本待測。 (3) H. pylori疫苗免疫保護接種:6~8周齡的清潔級BALB/c小鼠隨機分為以下3組:正常對照組:不接種疫苗也不給予H. pylori攻擊;疫苗對照組:PBS溶液;疫苗免疫組:H. pylori抗原+殼聚糖顆粒+CT組,后二組于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,末次免疫后4周給予1.0×109CFU/ml的SS1 H. pylori菌液0.5ml/只進行攻擊,隔日一次,共2次。4周后,處死小鼠,取標本待測。 (4)各項指標檢測:①胃黏膜內(nèi)H. pylori的檢測:采用改良Giemsa染色和H. pylori定量培養(yǎng);②血清抗H. pylori IgG1、IgG2a和胃黏膜內(nèi)IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10含量的檢測:采用間接ELISA法和雙抗體夾心ELISA法;③脾和淋巴細胞細胞內(nèi)Tim-1和Tim-3 mRNA檢測:采用RT-PCR方法。④Tim-3陽性細胞檢測:采用流式細胞術(shù)。 研究結(jié)果: (1) H. pylori對小鼠淋巴細胞內(nèi)Tim-1及Tim-3表達的影響: ①H. pylori活菌作用小鼠淋巴細胞3h后對小鼠淋巴細胞內(nèi)Tim-1 mRNA的表達無顯著影響(P0.05),但是在6h、12h和24h時不同濃度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴細胞可顯著影響其Tim-1 mRNA的表達(P0.01,0.05,0.001)。在6h和12h時,0.50×10~7CFU/ml和1.00×10~7CFU/ml濃度組顯著低于對照組(P0.05);但是在高濃度(2.00×10~7CFU/ml和4.00×10~7CFU/ml)時,Tim-1 mRNA表達回升,與對照組無差別(P0.05),并高于低濃度組(P0.05,0.005)。在24h時,在0.50×10~7CFU/ml至2.00×10~7CFU/ml濃度范圍內(nèi),隨著H. pylori活菌濃度增加,Tim-1 mRNA的表達下降,其中1.00×10~7CFU/ml和2.00×10~7CFU/ml組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.005);在高濃度組(4.00×10~7CFU/ml),Tim-1 mRNA表達回升,與對照組無差別(P0.05),并高于低濃度組(P0.005,0.001,0.001)。 ②H. pylori活菌作用小鼠淋巴細胞3h和24h后對小鼠淋巴細胞內(nèi)Tim-3 mRNA的表達無顯著影響(P0.05),但是在6h和12h時不同濃度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴細胞可顯著影響其Tim-3 mRNA的表達(P0.01,0.001),隨著H. pylori活菌濃度增加,Tim-3 mRNA的表達逐漸升高。在6h時,2.00×10~7CFU/ml和4.00×10~7CFU/ml濃度組顯著高于對照組和0.50×10~7CFU/ml濃度組(P0.005,0.05)。在12h時,2.00×10~7CFU/ml濃度組顯著高于對照組、0.50×10~7CFU/ml和1.00×10~7CFU/ml濃度組(P0.05),而4.00×10~7CFU/ml濃度組顯著高于對照組和其它各濃度組(P0.001,0.05)。 ③H. pylori活菌作用小鼠淋巴細胞3h后,其Tim-1/Tim-3 mRNA無顯著變化(P0.05);但是作用6h、12h和24h后,不同濃度的H. pylori活菌可顯著影響細胞Tim-1/Tim-3 mRNA的比值(P0.001,0.05,0.001)。在6h時,0.50×10~7CFU/ml和1.00×10~7CFU/ml濃度組顯著低于對照組(P0.05,0.01);在12h時,1.00×10~7CFU/ml濃度組顯著低于對照組(P0.005);在24h時,0.50×10~7CFU/ml、1.00×10~7CFU/ml和2.00×10~7CFU/ml濃度組顯著低于對照組(P0.005,0.001,0.001)。在這3個時間點的高濃度組(4.00×10~7CFU/ml),Tim-1/Tim-3 mRNA的比值回升,與對照組無差別(P0.05),并且高于低濃度組(P0.001)。 ④流式細胞儀檢測表明,H. pylori活菌作用小鼠淋巴細胞24h后Tim-3陽性細胞百分比無變化(P0.05),但是在6h和12h時不同濃度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴細胞可顯著增加Tim-3陽性細胞的百分比(P0.05)。在6h時,4.00×10~7CFU/ml濃度組顯著高于對照組(P0.01)和0.50×10~7CFU/ml濃度組(P0.001),2.00×10~7CFU/ml濃度組顯著高于0.50×10~7CFU/ml濃度組(P0.05)。在12h時,2.00×10~7CFU/ml濃度組顯著高于對照組(P0.05)、0.50×10~7CFU/ml(P0.005)和1.00×10~7CFU/ml濃度組(P0.05)。 (2)小鼠H. pylori感染和根除后Tim-1及Tim-3表達的變化: H. pylori感染組小鼠脾臟Tim-1 mRNA的表達顯著低于正常對照組(P0.05),H. pylori根除后小鼠脾臟Tim-1 mRNA的表達顯著增加,高于感染組(P0.05),與正常對照組無差別(P0.05)。H. pylori感染組小鼠脾臟Tim-3 mRNA的表達顯著高于正常對照組(P0.05),H. pylori根除后小鼠脾臟Tim-3 mRNA的表達顯著下降,低于感染組(P0.05),與正常對照組無差別(P0.05)。H.pylor感染小鼠脾臟Tim-1/Tim-3 mRNA顯著低于正常對照組(P0.05),H. pylori根除后小鼠脾臟Tim-1/Tim-3 mRNA顯著增加,高于感染組(P0.05),與正常對照組無差別(P0.05)。 (3)小鼠免疫保護疫苗接種后Tim-1及Tim-3表達的變化: 疫苗免疫組小鼠脾臟Tim-1和Tim-3 mRNA的表達均顯著高于正常對照組和疫苗對照組(P0.001~0.05)。疫苗對照組小鼠脾臟Tim-3 mRNA的表達顯著高于正常對照組(P0.05)。小鼠脾臟Tim-1/Tim-3 mRNA的比值在疫苗對照組顯著低于正常對照組(P0.05),而在疫苗免疫組此比值顯著增加,高于疫苗對照組(P0.001),與正常對照組無差別(P0.05)。 (4)小鼠H. pylori感染和根除后以及H. pylori疫苗接種各組Tim-1及Tim-3與Th免疫反應的關(guān)系: 1)小鼠H. pylori感染和根除后Tim-1及Tim-3與Th免疫反應: ①血清抗H. pylori IgG1和IgG2a含量在H. pylori感染組及H. pylori根除組均顯著高于正常對照組(P0.001,0.01和0.05),在H. pylori感染組與H. pylori根除組之間無顯著差異(P0.05)。并且在各組小鼠脾臟Tim-1 mRNA的表達與血清抗H. pylori IgG1含量(反映Th2免疫反應)呈顯著正相關(guān)(P0.001,0.05),與血清抗H. pylori IgG2a含量(反映Th1免疫反應)無相關(guān)性(P0.05);而脾臟Tim-3 mRNA的表達與血清抗H. pylori IgG2a含量呈顯著正相關(guān)(P0.01,0.05),與血清抗H. pylori IgG1含量無相關(guān)性(P0.05)。 ②胃黏膜內(nèi)IL-4、IL-10和IL-12含量在對照組、H. pylori感染和根除組之間無顯著差異(P0.05),各組間IL-2和IFN-γ含量有顯著差異(P0.01,0.05)。進行兩兩比較發(fā)現(xiàn),IL-2和IFN-γ含量在H. pylori感染組高于正常對照組和H. pylori根除組(P0.005,0.01和0.05),H. pylori根除組與正常對照組無差別(P0.05)。并且各組小鼠脾臟Tim-1 mRNA的表達與胃黏膜內(nèi)IL-4和IL-10(Th2細胞因子)含量呈顯著正相關(guān)(P0.005,0.01和0.05),與IL-2、IFN-γ和IL-12(Th1細胞因子)含量無相關(guān)性(P0.05);而脾臟Tim-3 mRNA的表達與胃黏膜內(nèi)IL-2、IFN-γ和IL-12含量呈顯著正相關(guān)(P0.005,0.05),與IL-4和IL-10含量無相關(guān)性(P0.05)。 2)小鼠疫苗接種各組Tim-1及Tim-3與Th免疫反應: ①血清抗H. pylori IgG1和IgG2a含量在H. pylori疫苗接種組均顯著高于疫苗對照組與正常對照組(P0.001),血清中抗H. pylori IgG1含量在疫苗對照組還顯著高于與正常對照組(P0.01)。并且在各組小鼠脾臟Tim-1 mRNA的表達與血清抗H. pylori IgG1含量呈顯著正相關(guān)(P0.05),與血清抗H. pylori IgG2a含量無相關(guān)性(P0.05);而脾臟Tim-3 mRNA的表達與血清抗H. pylori IgG2a含量呈顯著正相關(guān)(P0.001,0.05),與血清抗H. pylori IgG1含量無相關(guān)性(P0.05)。 ②疫苗接種各組間胃黏膜內(nèi)IL-4含量無顯著差異(P0.05);IL-10、IL-2、IFN-γ和IL-12含量有顯著差異(P0.001,0.005),疫苗免疫組均高于正常對照組和疫苗對照組(P0.001,0.005和0.05),IFN-γ和IL-12含量在疫苗對照組顯著高于正常對照組(P0.01和0.05),IL-10含量在疫苗對照組顯著低于正常對照組(P0.05)。并且在各組小鼠脾臟Tim-1 mRNA的表達與胃黏膜內(nèi)IL-4和IL-10含量呈顯著正相關(guān)(P0.001,0.005,0.01和0.05),與IL-2、IFN-γ和IL-12含量無相關(guān)性(P0.05);而脾臟Tim-3 mRNA的表達與胃黏膜內(nèi)IL-2、IFN-γ和IL-12含量呈顯著正相關(guān)(P0.005,0.01和0.05),與IL-4和IL-10含量無相關(guān)性(P0.05)。 結(jié)論: 1. H. pylori在體外可下調(diào)小鼠淋巴細胞Tim-1的表達,上調(diào)Tim-3的表達,并降低Tim-1/Tim-3比值,提示它可抑制T淋巴細胞向Th2細胞分化,促進T淋巴細胞向Th1細胞分化,誘導Th1優(yōu)勢的免疫反應。 2.在體內(nèi)H. pylori感染能下調(diào)小鼠脾臟內(nèi)Tim-1的表達,上調(diào)Tim-3的表達,使Tim-1/Tim-3比值下降,而H. pylori根除后Tim-1表達回升,Tim-3表達下降,Tim-1/Tim-3比值上升,提示H. pylori感染可誘導Th1優(yōu)勢的免疫反應,而H. pylori根除后可逆轉(zhuǎn)H. pylori感染所致的Th1優(yōu)勢的免疫反應。 3. H. pylori疫苗接種后可上調(diào)小鼠脾臟Tim-1和Tim-3 mRNA的表達,使Tim-1/Tim-3比值上升,提示H. pylori疫苗接種可誘導Th1和Th2混合免疫反應,并可逆轉(zhuǎn)H. pylori感染所致的Th2反應抑制,恢復Th1/Th2免疫反應的平衡。 4.在H. pylori感染和疫苗接種各組Tim-1的表達與反映Th2免疫反應的抗H. pylori IgG1含量和Th2細胞因子含量呈正相關(guān),而與反映Th1免疫反應的抗H. pylori IgG2a含量和Th1細胞因子含量無顯著相關(guān)性;Tim-3的表達則反之,說明在H. pylori感染和疫苗接種時Tim-1和Tim-3的表達能較好的反映Th2和Th1免疫反應,這為后續(xù)以Tim-1和Tim-3為靶點防治H. pylori感染和H. pylori相關(guān)性疾病提供了依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R573;R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 謝勇;周南進;熊水印;陳江;龔燕鋒;呂農(nóng)華;王崇文;;殼聚糖體內(nèi)抗幽門螺桿菌作用及其對Th免疫反應的調(diào)節(jié)[J];中華內(nèi)科雜志;2007年03期

2 謝勇,龔燕鋒,周南進,陳江,周小江,呂農(nóng)華,王崇文;胃黏膜局部免疫反應在以殼聚糖為佐劑的幽門螺桿菌疫苗免疫保護中的作用[J];中華醫(yī)學雜志;2005年37期

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本文編號：1512327