本文關鍵詞： 微小RNA 乙型肝炎病毒 肝細胞癌 乙肝病毒表面抗原 HepG22.2.15細胞 靶基因　出處：《天津醫(yī)科大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的： 在我國乙型肝炎病毒(HBV)相關性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)發(fā)病率、死亡率均排名于疾病譜前列,嚴重危害人民健康,目前尚無滿意的治療方法。為此尋找新的抗HBV治療方法成為當前急需解決的重要問題。近年發(fā)現(xiàn)的microRNA (miRNA),是一種廣泛存在于真核生物中、大小約18-25個核苷酸(nt)的內源性單鏈小分子RNA,參與發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。越來越多的研究表明,miRNA也能夠調控RNA和DNA病毒的復制。那么,miRNA是否也參與了HBV的復制呢?為此,我們首次研究了靶定于HBV基因組和宿主細胞基因組的人類的miRNA,為研究HBV和miRNA之間的相互作用及其機制奠定初步的實驗依據(jù),為今后抗HBV增殖藥物的開發(fā)提供新的手段和分子基礎。 方法： 1.分別用328種miRNA的反義鏈轉染HepG22.2.15細胞,72小時收獲上清,MTS檢測細胞的增殖活性,ELISA檢測表面抗原和e抗原的表達水平 2.將篩選到的對表面抗原產(chǎn)生有抑制作用和促進作用的miRNA的反義鏈梯度轉染HepG22.2.15細胞,72小時收獲上清,實時定量PCR檢測其中HBV的拷貝數(shù),ELISA檢測表面抗原和e抗原的表達水平。 3.用miRanda, TargetScan, PicTar, miRDB和ViTa五個網(wǎng)站預測篩選miRNA在HBV基因組上的靶基因,對于在HBV基因組上沒有靶位點的miRNA,網(wǎng)站預測的結果聯(lián)合mRNA表達譜芯片和RT-PCR技術,對其靶基因做進一步預測。 4.分別構建篩選到的miRNA的過表達載體,包含靶位點的EGFP報告載體和靶位點突變的EGFP報告載體。并且分別在HEK293和HepG22.2.15細胞中進行熒光報告載體實驗驗證候選的靶基因。 結果： 1.MTS和ELISA的結果顯示,在沒有對細胞的增殖活性產(chǎn)生影響的情況下,miR-199a-3p, miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的表達,而miR-370促進了病毒表面抗原的表達。 2.實時定量PCR的結果顯示,miR-199a-3p, miR-210和miR-185抑制了HBV的復制,這種抑制作用具有劑量依賴性。 3.網(wǎng)站預測了miR-199a-3p, miR-210, miR-185和miR-370的靶基因,miR-199a-3p, miR-210分別靶定于HBV的表面抗原和表面抗原的啟動子2。而在HBV上沒有發(fā)現(xiàn)miR-185和miR-370的靶位點,通過mRNA表達譜芯片結合生物信息學的方法,我們篩選到miR-185可能的靶基因有PRKCH,ATP5B和NR1D1, miR-370可能的靶基因有FUS和TPM4。并且通過RT-PCR和芯片驗證,PRKCH, ATP5B的RT-PCR結果和芯片結果相符。 4.在HEK293和HepG22.2.15兩種細胞中,利用熒光報告載體實驗驗證了miR-199a-3p, miR-210和miR-185與候選基因的直接作用關系,結果顯示,miR-199a-3p, miR-210, miR-185分別通過靶定HBsAg, HBSP2和PRKCH,從而抑制了HBV表面抗原的產(chǎn)生以及HBV的復制。 結論： 本研究首次發(fā)現(xiàn)了通過直接靶定HBV基因組或者宿主細胞基因,從而抑制病毒表面抗原產(chǎn)生和病毒復制的hsa-miRNA。miRNA作為病毒與宿主細胞相互作用中的調節(jié)因子(激活因子或抑制因子),在HBV的生命活動周期中具有重要作用。該研究對于闡明細胞miRNA和HBV之間錯綜復雜的相互作用提供了依據(jù),對于我們理解宿主和病原體之間內在的相互調控提供很大的幫助,可能為解釋病毒的組織嗜性,潛伏感染,和癌原性提供新的理論依據(jù),而且,病毒感染相關miRNA的研究有望成為抗病毒治療新的重要靶點。
[Abstract]:Objective:
In China, hepatitis B virus (HBV) related hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma, HCC) incidence rate, mortality rate ranks in the forefront of the spectrum of disease, serious harm to people's health, there is no satisfactory treatment. Looking for new anti HBV treatment method has become an important problem to solve. In recent years microRNA (miRNA), is a widely exist in eukaryotes, the size of about 18-25 nucleotides (NT) single stranded endogenous small molecule RNA, involved in the development, proliferation, differentiation, apoptosis and other biological processes. More and more studies show that miRNA can regulate RNA and DNA replication. So, miRNA is involved in the replication of HBV? For this, we first studied the target HBV genome and the genome of the host cell of human miRNA, provide a preliminary experimental basis for research between HBV and miRNA and its interaction mechanism, It provides a new means and a molecular basis for the development of anti HBV proliferative drugs in the future.
Method錛，

本文編號：1504514