本文關(guān)鍵詞： 白念珠菌 耐藥性 MIR1 基因敲除　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：白念珠菌的耐藥性產(chǎn)生已成為臨床白念珠菌感染治療失敗的主要原因。本課題組長期致力于白念珠菌耐藥機制的研究,我們前期的研究結(jié)果提示MIR1和白念珠菌耐藥性的形成密切相關(guān)。本課題利用基因敲除技術(shù)系統(tǒng)性的考察了MIR1的功能：采用Ura-Blaster策略將MIR1的兩個等位基因從白念珠菌的基因組中敲除,構(gòu)建了MIR1基因缺失菌繼而用以研究MIR1的功能。研究結(jié)果顯示：MIR1基因敲除后白念珠菌生長速度減慢；通過生物被膜的生長動力學(xué)測定(XTT法)、激光共聚焦顯微鏡(CSLM)觀察生物被膜和細胞表面疏水性(CSH)測定等方法考察了MIR1對白念珠菌菌絲和生物被膜形成能力的影響,結(jié)果顯示MIR1基因缺失菌形成菌絲和被膜的能力下降,MIR1基因減弱生物被膜和菌絲的生成能力。上述結(jié)果提示：MIR1基因在白念珠菌的生物被膜形成中發(fā)揮重要作用。考察MIR1基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊懀簩嶒灲Y(jié)果顯示MIR1基因?qū)Ψ颠�、酮康唑和特比奈芬藥物敏感性降�?Spot assay和Filter disk assay結(jié)果一致。隨后我們對基因敲除后藥物敏感性下降的機制進行了探討。羅丹明6G實驗結(jié)果顯示：MIR1敲除后白念珠菌對藥物外排能力增加,即藥物外排泵的功能增強；但是檢測一系列耐藥相關(guān)基因結(jié)果發(fā)現(xiàn),耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達沒有發(fā)生明顯變化。因為羅丹明6G是能量依賴型物質(zhì)外排,所以考察了細胞內(nèi)ATP的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MIR1基因敲除后,細胞內(nèi)ATP水平升高；一般情況下,有氧呼吸的線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌毎麅?nèi)ATP的主要來源,考察線粒體膜電位水平發(fā)現(xiàn)：MIR1基因敲除后,線粒體功能的直接指標(biāo)——線粒體膜電位升高。內(nèi)源性活性氧(ROS)超過一定濃度會對自身產(chǎn)生氧化損傷,是唑類藥物的主要抑菌因素之一；同時線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌毎麅?nèi)源性活性氧的主要來源,對MIR1基因敲除后進行內(nèi)源性活性氧測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MIR1敲除后,白念珠菌內(nèi)源性活性氧的增加程度低于親本菌。綜上所述,MIR1基因敲除后白念珠菌對藥物敏感性降低的原因,一方面是由于藥物外排泵的能量增加,使其功能增強；另一方面原因是敲除菌的內(nèi)源性活性氧的增加程度低于親本菌。本課題從多方面、多層次闡明,MIR1影響白念珠菌誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。
[Abstract]:The drug resistance of Candida albicans has become the main reason for the failure of clinical treatment of Candida albicans infection. Our previous results suggest that MIR1 is closely related to the formation of resistance to Candida albicans. This study systematically investigated the function of MIR1 by using gene knockout technique: Ura-Blaster strategy was used to remove two alleles of MIR1 from Candida albicans. Knockout in the genome, MIR1 gene deletion bacteria were constructed and used to study the function of MIR1. The results showed that the growth rate of Candida albicans was slowed down after the knockout of the 1: MIR1 gene. The effects of MIR1 on the formation of mycelium and biofilm of Candida albicans were investigated by means of the growth kinetics of biofilm and the observation of cell surface hydrophobicity by laser confocal microscope (CSLM) and the growth kinetics of biofilm. The results showed that the ability of MIR1 gene deletion bacteria to form mycelium and membrane decreased. The results indicated that the cell membrane formation of Candida albicans was played an important role in the formation of biofilm of Candida albicans by the reduction of biofilm and mycelium formation by MIR1 gene. The effect of MIR1 gene on drug sensitivity: the results showed that MIR1 gene had effect on fluconazole, The results of ketoconazole and terbinafine decreased drug sensitivity were consistent with those of Filter disk assay. Then we discussed the mechanism of drug sensitivity decrease after gene knockout. Rhodamine 6G experiment showed that Candida albicans after 1% MIR1 knockout. Increased drug efflux capacity, In other words, the function of drug efflux pump was enhanced, but the transcriptional expression of drug-resistance related genes was not changed significantly by detecting a series of drug-resistance related genes, because Rhodamine 6G was an energy-dependent efflux. So when we examined the level of ATP in cells, we found that the level of ATP increased after the knockout of the 1: MIR1 gene. In general, the mitochondrial respiratory chain of aerobic respiration was the main source of intracellular ATP. It was found that the mitochondrial membrane potential, the direct index of mitochondrial function, increased after the 1: MIR1 gene knockout. More than a certain concentration of endogenous reactive oxygen species (Ros) caused oxidative damage to the mitochondria. The mitochondrial respiratory chain was the main source of endogenous reactive oxygen species (Ros) in cells. The endogenous reactive oxygen species (Ros) were determined after knockout of the MIR1 gene, and the results showed that after 1% MIR1 knockout, the mitochondrial respiratory chain was the main source of endogenous reactive oxygen species (Ros). The increase of endogenous reactive oxygen species in Candida albicans was lower than that of parent strains. In conclusion, the reason for the decrease of drug sensitivity of Candida albicans after gene knockout of MIR1 gene was that, on the one hand, the energy of drug efflux pump increased and the function of Candida albicans increased. On the other hand, the increase of endogenous reactive oxygen species in knockout bacteria is lower than that of parent bacteria.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R379

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王魯,張雪,刁慶春,劉榮卿,鐘白玉;三株抗白念珠菌單克隆抗體的制備與鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年01期

2 廉翠紅,劉維達;與白念珠菌黏附和侵入相關(guān)的毒力因子研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2004年05期

3 李安生;;核苷和核苷酸對白念珠菌芽管形成的影響及細胞 cAMP 與芽管形成的關(guān)系[J];國際皮膚性病學(xué)雜志;1993年04期

4 呂桂霞;玉米粉液基培養(yǎng)促進白念珠菌厚壁孢子的形成[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;1999年03期

5 唐寧楓!210042南京,吳紹熙!210042南京,郭寧如!210042南京,焦端清,秦浚川;白念珠菌烯醇化酶的分離與純化[J];中華皮膚科雜志;2000年05期

6 張寶軍,葉慶俏,周村建,李彥,唐書謙,李芹階;白念珠菌ATCC-90028菌絲相的誘導(dǎo)[J];實用藥物與臨床;2005年02期

7 苑天紅,王明永,吳升偉,吳承龍;小鼠腹腔吞噬細胞對二相性白念珠菌的吞噬研究[J];貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年04期

8 秦曉峰;吳建華;賈鑫明;顧軍;姜遠英;;白念珠菌臨床株FLU1基因表達與氟康唑耐藥的關(guān)系[J];中華皮膚科雜志;2006年08期

9 秦振宇,譚升順,陳康,黨少農(nóng);菌株數(shù)值分類程序設(shè)計及其在白念珠菌菌株相似性分析中的初步應(yīng)用[J];中國皮膚性病學(xué)雜志;1997年05期

10 劉維達,吳紹熙,朱一元;白念珠菌厚膜孢子形態(tài)發(fā)生過程的掃描電鏡觀察[J];中國人獸共患病雜志;1998年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 閻瀾;李妙海;曹永兵;高平揮;王彥;姜遠英;;白念珠菌耐藥新蛋白——交替氧化酶[A];藥學(xué)發(fā)展前沿論壇及藥理學(xué)博士論壇論文集[C];2008年

2 徐永豪;李春陽;;耐氟康唑白念珠菌所致外陰陰道念珠菌病1例[A];中華醫(yī)學(xué)會第14次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

3 陳興;侯天文;白云;李瑋;陳晶;郭曉麗;劉艷麗;;住院患者念珠菌菌尿的調(diào)查[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

4 張欣;蘇雯靜;李巍;安金剛;劉玉峰;;單克隆天然抗體3B4抑制白念珠菌芽管形成的機制初探[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

5 郭仁勇;;白念珠菌聚苯乙烯黏附增強基因1的研究進展[A];2008年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

6 劉澤虎;呂雪蓮;呂桂霞;沈永年;徐宏彬;陳偉;胡素泉;劉維達;;煙曲霉選擇性培養(yǎng)基的實驗研究[A];2008全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

7 賈鑫明;曹永兵;王彥;姜遠英;;白念珠菌RTA2是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路介導(dǎo)的耐藥性產(chǎn)生的靶基因[A];藥學(xué)發(fā)展前沿論壇及藥理學(xué)博士論壇論文集[C];2008年

8 陳官芝;馬海麗;;念珠菌黏附特性對比研究[A];2007中華醫(yī)學(xué)會第二次醫(yī)學(xué)真菌學(xué)術(shù)會議暨醫(yī)學(xué)真菌實驗室研究技術(shù)新進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

9 秦曉峰;吳建華;黃懿;張麗娟;姜遠英;顧軍;;微量稀釋法測定白念珠菌對氟康唑的MIC值及兩種藥敏試驗的比較[A];2008全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

10 楊繼君;陳興平;;白念珠菌生物膜形成不同時期對氟康唑敏感性的初步研究[A];“環(huán)境與健康”學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 鄒先彪;白念珠菌感染的預(yù)警[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

2 中國醫(yī)科院皮膚病研究所教授 吳紹熙;從誤診病例談臨床思維[N];健康報;2007年

3 健康時報實習(xí)記者　 梁璐;瘙癢部位不同用藥有別[N];健康時報;2006年

4 范高明;艾格生蛋黃免疫球蛋白 筑起國民免疫新長城[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2003年

5 丁潔 傳寶;太鋼成功研發(fā)新型抗菌不銹鋼[N];太原日報;2006年

6 記者 陳強 通訊員 蔣淑芬 賈寧;太鋼成功研發(fā)出新型抗菌不銹鋼[N];中國冶金報;2006年

7 記者　齊作權(quán) 通訊員　黃傳寶;永恒抗菌不銹鋼在太鋼問世[N];山西日報;2006年

8 記者衣曉峰 靳萬慶 通訊員莊磊;臨床研究證實甲真菌病病原菌種發(fā)生變遷[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

9 本報記者 包斯文;經(jīng)濟新穎和抗菌型不銹鋼市場前景廣闊[N];中國冶金報;2004年

10 ;抗菌不銹鋼在沈陽研制成功[N];今日信息報;2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 許懿;小檗堿與氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌的作用機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 王琳;白念珠菌耐藥相關(guān)蛋白Rta2p與脂筏關(guān)系研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

3 曹永兵;轉(zhuǎn)錄因子Caplp促進白念珠菌抗藥性形成的分子機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 焦?jié)升?重組Sap2蛋白接種對免疫抑制小鼠系統(tǒng)感染白念珠菌的保護作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2011年

5 劉偉;白念珠菌CaSCH9基因功能研究[D];天津大學(xué);2010年

6 吳建華;白念珠菌細胞周期及抗真菌中藥單體對其影響的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

7 賀志彬;白念珠菌耐藥基因CDR1基因表達調(diào)控機制的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 陳臘梅;攜帶G487T和T916C突變的白念珠菌耐藥基因表達與氟康唑耐藥關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2010年

9 陳孫孝;白念珠菌鈣調(diào)蛋白基因(CMD1)缺陷菌株的構(gòu)建及CMD1功能性基因的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

10 王惠平;應(yīng)用滾環(huán)擴增技術(shù)對白念珠菌耐氟康唑相關(guān)基因點突變的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 黃海;白念珠菌MIR1基因的功能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 劉朝紅;漢防己甲素對氟康唑抗白念珠菌生物膜增效活性的初步研究[D];暨南大學(xué);2010年

3 鐘毅;白念珠菌蘋果酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)及功能初步研究[D];中山大學(xué);2012年

4 張蕾;紫外線對白念珠菌生長的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

5 陳文峰;雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑體外抗白念珠菌活性的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

6 商慶華;魚腥草素鈉抗白念珠菌的作用及機制研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2012年

7 郭雅莉;白念珠菌多位點序列分型研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

8 董玲玲;生物被膜型白念珠菌代謝物分析及代謝變化的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

9 黃悅;白念珠菌HOG基因致病相關(guān)性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

10 仇萌;白念珠菌Sap2快速檢測方法的建立[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2012年

，

本文編號：1504400