本文關(guān)鍵詞： 淡色庫蚊 溴氰菊酯 抗藥性 EU073017基因 克隆 定量PCR 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 細(xì)胞存活率　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 【目的】克隆淡色庫蚊EU073017基因,研究其與蚊抗藥性關(guān)系。 【方法】根據(jù)本試驗(yàn)室抑制性差減雜交(suppression subtractivehybridization,SSH)結(jié)合cDNA芯片篩選獲得的EST片段(GenBankno.BE 247823),設(shè)計(jì)引物,從淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA文庫中分別擴(kuò)增出目的基因的5'和3'末端,T/A克隆于pGT載體,轉(zhuǎn)化、測序、對(duì)位拼接獲取基因序列。生物信息學(xué)軟件分析EU073017基因編碼的氨基酸序列。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證EU073017基因在淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系和敏感品系(4齡幼蟲期)的表達(dá)差異。應(yīng)用基因重組方法構(gòu)建EU073017基因的昆蟲表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染入白紋伊蚊C6/36細(xì)胞,經(jīng)藥物篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞系;RT-PCR鑒定目的基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平。Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞系對(duì)溴氰菊酯的敏感性變化。 【結(jié)果】獲得淡色庫蚊EU073017基因,長度為398bP,編碼序列(coading sequence,CDS)長度為270 bp,推導(dǎo)編碼89個(gè)氨基酸(GenBank no.ABU49655,2007)。該推導(dǎo)氨基酸序列與致死按蚊(Anopheles funestus)、岡比亞按蚊(An.gambiae)和埃及伊蚊(Aedesaegypti)同源基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為86%、84%和80%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,EU073017基因在溴氰菊酯抗性品系(4齡幼蟲期)中的表達(dá)是敏感品系(4齡幼蟲期)中表達(dá)的1.65倍。成功構(gòu)建了EU07301基因的昆蟲表達(dá)載體,并構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EU073017基因的單克隆細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)溴氰菊酯敏感性測定結(jié)果顯示:在40、60、80、100和120μM濃度的溴氰菊酯處理下,轉(zhuǎn)染EU073017基因的蚊細(xì)胞存活率要高于對(duì)照組細(xì)胞系的存活率(p＜0.05)。 【結(jié)論】本研究克隆了淡色庫蚊EU073017基因。該基因在淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系中高表達(dá)。轉(zhuǎn)染EU073017基因可提高蚊細(xì)胞對(duì)溴氰菊酯的抵抗性。
[Abstract]:[objective] to clone the EU073017 gene of Culex pipiens pallens and study its relationship with the drug resistance of Culex pipiens pallens. [methods] according to the suppression subtractive subtractive hybridization (SSH) and cDNA chip screening of EST fragment GenBankno.be 247823 in this laboratory, primers were designed. From the cDNA library of Culex pipiens pallens deltamethrin resistance strain, the 5 'and 3'terminal TPA of the target gene were cloned into pGT vector, transformed and sequenced. Acquisition of gene sequences by pairwise splicing. Analysis of amino acid sequences encoded by EU073017 gene by bioinformatics software. Real-time fluorescence quantitative PCR verification of EU073017 gene in 4th instar larvae of Culex pipiens pallens deltamethrin resistant and sensitive strains). The insect expression vector of EU073017 gene was constructed by gene recombination method. After transfection into C6 / 36 cell line of Aedes albopictus, stable transfection monoclonal cell line was obtained by RT-PCR. The sensitivity of the transfected cell line to deltamethrin was detected by using the cell Counting Kit-8 CCK-8 kit. [results] the EU073017 gene of Culex pipiens pallens was obtained. The length of the deduced amino acid sequence was 398bPand the length of the coding sequence was 270bp.The deduced amino acid sequence was GenBank no. ABU49655Anopheles funestusus, Anopheles gambiae (Anopheles gambiae) and Aedes aedesaegypti (Aedes aegypti). The deduced amino acid sequence was homologous to Anopheles funestusus, Anopheles gambiaeus and Aedes aedesaegyptii, respectively. The deduced amino acid sequence was homologous to Anopheles funestusus. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression of EU073017 gene in deltamethrin resistant strain was 1.65 times higher than that in sensitive strain of 4th instar larval stage. The insect expression vector of EU07301 gene was successfully constructed. A monoclonal cell line stably transfected with EU073017 gene was constructed. The sensitivity of stable transfection cells to deltamethrin was determined. The survival rate of mosquito cells transfected with EU073017 gene was higher than that of control cell lines (p < 0.05). [conclusion] in this study, the EU073017 gene of Culex pipiens pallens was cloned and overexpressed in the deltamethrin resistant line of Culex pipiens pallens. Transfection of EU073017 gene can enhance the resistance of mosquito cells to deltamethrin.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R383

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本文編號(hào)：1497603