本文關(guān)鍵詞： 干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞 胚胎生殖細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞 不對(duì)稱分裂 多能性 RNA干擾　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 干細(xì)胞( stem cells )是生命科學(xué)研究的重要工具。一方面可用于研究增殖、分化、生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、死亡等最基本的生命現(xiàn)象,另一方面經(jīng)體外誘導(dǎo)可用于臨床細(xì)胞治療和組織工程材料研究,為一些目前難治性疾病的治療帶來(lái)新的希望。隨著對(duì)干細(xì)胞生理特性認(rèn)識(shí)的深入,研究者們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞有很多共同特點(diǎn),認(rèn)為腫瘤很可能是干細(xì)胞在長(zhǎng)期的自我更新過(guò)程中,由于多基因突變導(dǎo)致干細(xì)胞生長(zhǎng)失去正常調(diào)控,而停止在分化的某一階段無(wú)限制增殖所形成的,腫瘤組織內(nèi)存在干細(xì)胞-腫瘤干細(xì)胞。本研究討論人生殖嵴干細(xì)胞多能性及其不對(duì)稱分裂機(jī)制,以及胚胎干細(xì)胞多能性因子在腫瘤發(fā)生中的作用。 本研究的第一章內(nèi)容討論人生殖嵴干細(xì)胞多能性及其不對(duì)稱分裂機(jī)制。 胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著十分誘人的應(yīng)用前景。胚性多能性干細(xì)胞具有體外分化方向不確定性,分化為所有細(xì)胞類型的潛能。因此,多能性干細(xì)胞在疾病治療和組織工程中是一種重要的資源。多能性干細(xì)胞也是體外研究胚胎發(fā)育的一種重要工具。目前,人多能性干細(xì)胞包括三種類型:人胚胎干細(xì)胞(ESC)、人胚胎生殖細(xì)胞(EGC)和人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)。人胚胎干細(xì)胞(ESC)起源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán),而人胚胎生殖細(xì)胞(EGC)由發(fā)育后期的原始生殖細(xì)胞(PGC)發(fā)育而來(lái)。人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)來(lái)源于重編程的成體細(xì)胞,這種成體細(xì)胞的重編程主要是通過(guò)人為導(dǎo)入一些胚胎多能性干細(xì)胞因子:如OCT4, SOX2, NANOG等使細(xì)胞獲得多能性。 毫無(wú)疑問(wèn),人類胚胎干細(xì)胞(ESC)在組織重建、分化和基因功能等多方面的研究中吸引了公眾的眼球,同時(shí),人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)也在2007年涌現(xiàn)在世人面前。然而,到目前為止,僅有少數(shù)的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)人胚胎生殖細(xì)胞(EGC)進(jìn)行了了研究報(bào)道。生殖細(xì)胞系擔(dān)負(fù)著遺傳信息的世代傳遞,因此自然不同于ESC和iPS。體外建立和誘導(dǎo)EGC分化為研究再生工程分子機(jī)制提供了一個(gè)范例。因此,給予EGC研究更多的觀注就顯得尤其重要。 不同于ESCs和iPS,研究人員發(fā)現(xiàn)hEGCs在培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)速度緩慢,并且很難培養(yǎng)大量的未分化hEGCs,這將較大的限制了hEGCs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。一些研究者發(fā)現(xiàn)人生殖干細(xì)胞(hEGCs)可能進(jìn)行的是不對(duì)稱分裂。Numb是一個(gè)重要的細(xì)胞命運(yùn)決定子,在細(xì)胞不對(duì)稱分裂中通過(guò)負(fù)調(diào)控Notch1信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂。本研究通過(guò)免疫熒光化學(xué)等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Numb在原始生殖細(xì)胞hPGCs和人胚胎生殖細(xì)胞hEGCs中的表達(dá)和不對(duì)稱分布。在培養(yǎng)的hEGCs單個(gè)細(xì)胞中,Numb的不對(duì)稱分布被觀察到,Numb呈月牙形分布,這一現(xiàn)象和其它神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行不對(duì)稱分裂時(shí),Numb的分布相似。 本研究進(jìn)一步檢測(cè)了Numb功能被抑制之后對(duì)hEGCs細(xì)胞增殖的影響。為此,構(gòu)建了一DOX誘導(dǎo)的siRNA干擾系統(tǒng):慢病毒載體pLKO-Tet-On-TRE U6-puro sh Numb。通過(guò)Numb RNA干擾的方法可以使hEGCs的生長(zhǎng)增殖方式改變,由緩慢的增殖轉(zhuǎn)變?yōu)橥⒃鲋?細(xì)胞的分裂方式可能從不對(duì)稱分裂轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)稱分裂。這一結(jié)果進(jìn)一步提示Numb蛋白參與了hEGCs細(xì)胞分裂的調(diào)控。 Numb蛋白是Notch1信號(hào)通路的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子,那么hEGCs的分裂是否也是受Numb/Notch1信號(hào)通路的調(diào)控呢?本文通過(guò)免疫熒光化學(xué)和流式細(xì)胞技術(shù)等進(jìn)行了驗(yàn)證:在SiN-hEGCs克隆中,由于Numb的表達(dá)受到抑制,Notch1的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在hEGCs細(xì)胞中Numb/Notch1信號(hào)通路被激活,并且介導(dǎo)了hEGCs的細(xì)胞分裂。因此,也進(jìn)一步揭示Numb調(diào)控hEGCs細(xì)胞不對(duì)稱分裂是通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)通路。 同時(shí),通過(guò)這種方法得到的EG細(xì)胞,保持了胚胎生殖干細(xì)胞的特征,表達(dá)一系列的干細(xì)胞標(biāo)志分子,如堿性磷酸酶AP,SSEA-1, SSEA-4, Oct-4, Nanog, Pum2, C-kit和Vasa等分子;同時(shí)維持了胚胎干細(xì)胞的多能性:在體外培養(yǎng)時(shí),能構(gòu)形成類胚體EBs (embryoid bodies)。 本研究結(jié)果顯示:發(fā)現(xiàn)不對(duì)稱分裂的細(xì)胞命運(yùn)決定子Numb在人PGCs和EGCs中表達(dá),并且Numb在子代細(xì)胞中呈不對(duì)稱分布從而導(dǎo)致EG細(xì)胞的不對(duì)稱分裂。這種不稱分裂可以通過(guò)RNA干擾Numb的表達(dá)而逆轉(zhuǎn),使EG細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橥⑸L(zhǎng)。進(jìn)一步的研究表明,Numb蛋白的表達(dá)下調(diào)后促進(jìn)EG的增殖是因?yàn)镹umb蛋白的表達(dá)下調(diào)激活了Notch1信號(hào)通路。 本研究的第二章內(nèi)容主要討論胚胎干細(xì)胞多能性因子在腫瘤發(fā)生中的作用。盡管在過(guò)去的幾十年里人類對(duì)于惡性腫瘤的診斷和治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步,但是從實(shí)際的治療情況來(lái)看腫瘤病人仍沒(méi)有得到令人滿意的治療效果,對(duì)于大多數(shù)的惡性腫瘤我們依然束手無(wú)策。成功的根除這類疾病需要我們更加深入的了解腫瘤的起源和發(fā)展過(guò)程。目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(CSCLC)在腫瘤的起源和發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用,所以應(yīng)用干細(xì)胞生物學(xué)方法研究靶向這些惡性腫瘤干細(xì)胞治療方法成為治愈腫瘤的希望。 目前,越來(lái)越多的研究資料顯示CSCLC具有正常干細(xì)胞的形態(tài)和性質(zhì),而且可能通過(guò)一些特異調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞行為的信號(hào)通路來(lái)維持CSCLC的生存。調(diào)控干細(xì)胞行為的機(jī)制有兩個(gè)重要的特點(diǎn):多能性和潛在的無(wú)限增殖特性。正常干細(xì)胞一般有兩種狀態(tài):一是處于一種未分化狀態(tài),此時(shí)它們可以通過(guò)自我更新來(lái)重建自我并且能夠無(wú)限增殖;或者在一定條件下迅速分化,這時(shí)它們就會(huì)喪失自我更新的能力。干細(xì)胞多能性的維持主要是通過(guò)以O(shè)ctamer 4 (Oct4), Nanog和BMPs等一系列信號(hào)分子為起始的信號(hào)通路,其中Oct4研究的最為廣泛。Oct4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員,在胚胎干細(xì)胞和成人干細(xì)胞上均有表達(dá)。最近的研究表明Oct4不但可以維持胚胎干(ES)細(xì)胞的多能性,而且可以控制其無(wú)限增殖的特性。Oct4/Tcl1/Akt1信號(hào)通路已被證實(shí)參與ES細(xì)胞的增殖調(diào)控,主要是通過(guò)抑制ES細(xì)胞的凋亡來(lái)維持其增殖。有意思的是,研究者在生殖細(xì)胞腫瘤和一些體細(xì)胞腫瘤如肝癌、乳腺癌、膀胱癌和黑色素瘤(B16F10)中也同樣發(fā)現(xiàn)了Oct4。盡管許多腫瘤細(xì)胞都表達(dá)Oct4,但是它在這些腫瘤中所起的作用我們?nèi)匀恢跎�。此�?許多腫瘤細(xì)胞都表達(dá)Oct4分子從而表現(xiàn)出一些干細(xì)胞的特性,所以O(shè)ct4可以看作是CSCLC的重要標(biāo)志。因此闡明Oct4的表達(dá)是否參與了維持CSCLC的存活狀態(tài)這一問(wèn)題具有重要意義。 在本研究中通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn),應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功抑制兩種體細(xì)胞腫瘤模型中Oct4基因的表達(dá)(小鼠3LL細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞MCF7)。研究證實(shí)減少Oct4分子在體細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)將會(huì)使腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 為了進(jìn)行靶向腫瘤干細(xì)胞中的Oct4RNA干擾研究,首先檢測(cè)鑒定了3LL腫瘤細(xì)胞中Oct4的表達(dá)。為此,3LL腫瘤細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞MCF7被Oct4抗體標(biāo)記,并進(jìn)行流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示所有的3LL腫瘤細(xì)胞和MCF7都高表達(dá)Oct4。Oct4RNA干擾實(shí)驗(yàn)顯示,體外培養(yǎng)的3LL和MCF7腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)胚胎干細(xì)胞多能性細(xì)胞因子Oct4,并且采用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)Oct4的表達(dá)將最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。同時(shí),在體內(nèi)SiRNA干擾Oct4能成功減少腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(CSCLC)數(shù)量并顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。 最近的研究報(bào)道表明: Oct4/Tcl1/ Akt1信號(hào)通路不僅直接調(diào)控ES細(xì)胞的分化,而且還調(diào)控細(xì)胞的增殖。那么這個(gè)信號(hào)通路是否參與了腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控?本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示,Oct4/Tcl1/ Akt1信號(hào)通路的激活可能介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。也就是說(shuō)Oct4可能是通過(guò)阻止細(xì)胞的凋亡來(lái)維持腫瘤細(xì)胞的增殖。 總之,本研究證實(shí)通過(guò)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Oct4分子的表達(dá)能夠成功誘導(dǎo)CSCLC的凋亡以及抑制腫瘤體的生長(zhǎng),并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)肯定了Oct4/Tcl1/Akt1通路在此過(guò)程中發(fā)揮了部分作用。因而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)烈提示這種靶向抑制干細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路的策略能夠成功的應(yīng)用到腫瘤的治療中去,為臨床治療腫瘤奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1497315