本文關(guān)鍵詞： ZHX2 多克隆抗體 肝癌 融合蛋白 抑癌基因　出處：《山東大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： ZHX2(zinc finger homodomain box 2)是2003年發(fā)現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)錄抑制因子,其目前已知的三個靶基因均在肝癌中特異性高表達。我們的前期研究結(jié)果顯示ZHX2參與人肝癌細胞AFP表達調(diào)控,并抑制肝癌細胞生長。另有研究顯示ZHX2參與多種疾病發(fā)生,其表達與多發(fā)性骨髓瘤病人預(yù)后負相關(guān)。因而,ZHX2可能在腫瘤診斷和治療中具有重要研究價值。 研究目的 在原核細胞中表達人ZHX2的融合蛋白GST-ZHX2作為抗原,制備多克隆抗體,并利用該抗體檢測肝癌組織及不同腫瘤細胞系中ZHX2的表達。 研究方法 1 GST-ZHX2融合蛋白的表達 ZHX2融合蛋白表達載體pGEX-ZHX2(1-837AA)、pGEX-ZHX2(263-497AA)與空載體pGEX-5X-1分別經(jīng)CaCl_2法轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株,抽提質(zhì)粒并經(jīng)酶切、測序鑒定。以終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)工程菌表達目的蛋白,6h后收集菌體和上清液,分別進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色后,凝膠成像分析電泳圖像,通過Quantity One分析融合蛋白表達率。 2多克隆抗體制備 GST-ZHX2(1-837AA)、GST-ZHX2(263AA-497AA)融合蛋白分子量約118KDa和52KDa,GST蛋白分子量26KDa。將上述菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色后,對照分子量Marker,切取目的蛋白條帶的膠條(約含200gg融合蛋白)作為抗原,并添加2mlPBS后充分研磨,獲得“膠體-蛋白”乳濁液。將其與弗氏完全佐劑按照體積比2:1比例混合,多點注射入新西蘭大耳兔背部皮下,每2周免疫一次,共計3次(后兩次加強免疫時將含有200μg融合蛋白的膠條按照2:1比例與弗氏不完全佐劑混勻)。最后一次免疫后14天,心臟采血法采血,利用飽和硫酸銨法對兔血清中的免疫球蛋白進行粗提,分裝后-80℃保存,兩種ZHX2-GST融合蛋白免疫后血清分別標記為ZHX2(1-837AA)pAb和ZHX2(263-497AA)pAb。 3抗體特異性檢測 利用本實驗室構(gòu)建的ZHX2真核表達載體pcDNA3-ZHX2-HA及空載體pcDNA3分別轉(zhuǎn)染HepG2。48h后收集細胞,并分別利用上述制備的兩種多克隆抗體和商品化HA抗體(1:2000稀釋),進行western blot實驗,檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達。多克隆抗體按照1:100,1:500,1:1000,1:2000,1:4000比例稀釋,用于驗證該抗體對抗原識別的特異性,并確定抗體最適滴度。 4抗體應(yīng)用 收集肝癌切除術(shù)術(shù)后組織標本和不同腫瘤細胞系細胞,SDS裂解液提取組織蛋白及細胞蛋白,利用自行制備的ZHX2多克隆抗體進行Western blot,檢測ZHX2在肝癌組織及不同腫瘤細胞系中的表達水平。 結(jié)果 1 ZHX2融合蛋白在原核細胞中的表達 1.1重組質(zhì)粒pGEX-ZHX2(1-837AA)、pGEX-ZHX2(263-497AA)的鑒定 重組質(zhì)粒CaCl_2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),抽提陽性重組子質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHI和NotI雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,可見分子量約為2500bp與700bp左右的特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。DNA測序分析及BLAST對比分析證明,重組載體插入序列正確,pGEX-ZHX2(1-837AA)、pGEX-ZHX2(263-497AA)內(nèi)分別含有編碼ZHX2 1-837位氨基酸及263-497位氨基酸的相應(yīng)編碼序列。 1.2 GST-ZHX2(1-837AA)、GST-ZHX2(263-497AA)融合蛋白在原核細胞中的表達 工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h后,分別收集菌體及上清,進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色顯示:IPTG誘導(dǎo)的陽性工程菌菌體蛋白電泳后在118KDa、52KDa左右位置發(fā)現(xiàn)明顯深染蛋白條帶,而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對照組未見該條帶。上述結(jié)果提示:融合蛋白GST-ZHX2(1-837AA)、GST-ZHX2(263-497AA)可以在E.coli BL21(DE3)菌體中表達。 收集等量菌體總蛋白,SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色后,掃描膠體,利用Quantity One分析各條帶灰度,計算蛋白表達量。結(jié)果顯示:融合蛋白表達率分別為GST-ZHX2(1-837AA)5.4%,GST-ZHX2(263-497AA)10.9%和GST11.7%。 2 ZHX2多克隆抗體的制備 2.1抗原制備 大量培養(yǎng)工程菌,收集菌體蛋白,進行SDS-PAGE電泳,切取目的蛋白染色膠條[GST-ZHX2(1-837AA),118KDa;ZHX2-GST(263-497AA),52KDa;GST,26KDa)],根據(jù)蛋白表達率,按照每只兔子每次需要0.2mg抗原計算免疫動物所需膠體量,并秤取相應(yīng)膠條。 2.2 ZHX2多克隆抗體的制備及驗證 3次增強免疫結(jié)束后,采集并分離血清,硫酸銨沉淀法粗提血清免疫球蛋白IgG,用于Western blot檢測pcDNA3-ZHX2-HA轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中的ZHX2蛋白。ECL顯色結(jié)果顯示,商品化HA抗體可檢測出pcDNA3-ZHX2-HA轉(zhuǎn)染組中ZHX2-HA融合蛋白的表達,蛋白條帶位置在92KDa處;ZHX2(263-497AA)pAb、ZHX2(1-837AA)pAb亦可在相同位置檢測出的目的條帶,但ZHX2(1-837AA)pAb顯色后出現(xiàn)較多的非特異性雜帶。未轉(zhuǎn)染組和pcDNA3轉(zhuǎn)染組內(nèi),各抗體均未檢測到ZHX2表達。上述結(jié)果提示,ZHX2(263-497AA)pAb可以與ZHX2抗原進行特異性結(jié)合,用于后續(xù)實驗。 利用不同稀釋度的ZHX2多克隆抗體和相應(yīng)的HRP羊抗兔酶標二抗,重復(fù)上述實驗。結(jié)果證實一抗最佳抗體稀釋度為1:1000,二抗稀釋度1:500時實驗結(jié)果最佳。 3抗體的應(yīng)用 (1) ZHX2多克隆抗體檢測不同腫瘤細胞系中ZHX2表達 培養(yǎng)不同腫瘤細胞,并于對數(shù)生長期收集細胞,裂解后進行western blot。結(jié)果顯示,ZHX2(263-497AA)pAb多克隆抗體作用后,肝癌細胞系Bel-7402,SMMC-7721細胞中92Kda處可見特異性條帶,而HepG2和HepG2.2.15細胞中未見該條帶,與本室原有結(jié)果相符。提示,自行制備的ZHX2多克隆抗體具有良好的特異性和靈敏度,可以用于檢測培養(yǎng)細胞系中的ZHX2的表達。而在肺腺癌細胞系A(chǔ)549,子宮頸癌細胞系Hela,胃癌細胞系MGC-803和SGC-7901以及腺鱗癌細胞系的SKOV-3細胞內(nèi)均查出ZHX2的表達,但表達強弱不同。 (2) ZHX2多克隆抗體檢測不同肝癌組織標本中的ZHX2表達 隨機選取10名肝癌患者手術(shù)后肝癌組織標本,抽提組織蛋白后,用自行制備的ZHX2(263-497AA)pAb進行western blot檢測。結(jié)果顯示不同患者肝癌組織中均有ZHX2表達,但表達水平不一致。提示自行制備的多克隆抗體可以用于組織內(nèi)蛋白檢測,為進一步研究ZHX2與肝癌關(guān)系提供了有利生物材料。 結(jié)論 成功制備并鑒定ZHX2多克隆抗體,并用該抗體進行western blot檢測腫瘤細胞系和肝癌標本內(nèi)源性ZHX2的表達。結(jié)果顯示,制備的ZHX2多克隆抗體可以用于體內(nèi)外檢測,為進一步研究ZHX2與腫瘤關(guān)系及ZHX2功能研究提供了必要的條件。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 李靖波;植物乳桿菌P8亞油酸異構(gòu)酶近N端多肽的表達及其抗體的制備[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 唐蓮;豬硒蛋白IDⅡ和Sel S基因克隆、原核表達及多克隆抗體制備[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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本文編號：1491749