本文關(guān)鍵詞： 選擇性剪接 bcl-xL/bcl-xS 細(xì)胞凋亡 順式作用元件 反式作用因子 微基因報告法　出處：《南昌大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究目的： 選擇性剪接是指細(xì)胞選擇性地對pre-mRNA(前mRNA)剪接位點的組合剪接加工,形成不同的成熟mRNA,從而使一個基因產(chǎn)生若干有獨特結(jié)構(gòu)和功能的蛋白異構(gòu)體的過程,它是真核生物控制基因表達(dá)的一種重要機制。通過選擇性剪接,能夠大大增加人類基因組的蛋白編碼能力,從而滿足多種生理功能的需要。人類基因組中包含大量前mRNA正確剪接所需的順式元件,剪接的異�？蓪�(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。微基因是指將待研究的相關(guān)基因組片段插入真核表達(dá)載體啟動子下游及終止序列之間而構(gòu)建的重組載體,該重組質(zhì)粒能在真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出前mRNA,并在細(xì)胞不同的生理、病理狀態(tài)下剪接出不同mRNA產(chǎn)物。微基因用于監(jiān)測mRNA在不同情況下選擇性剪接可能發(fā)生的變化,是研究選擇性剪接發(fā)生機制的經(jīng)典方法。人類凋亡相關(guān)基因bcl-x選擇性剪接異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),本文通過構(gòu)建bcl-x微基因及其相關(guān)順式作用元件的突變微基因,建立bcl-x基因選擇性剪接微基因報告法,為闡明bcl-x基因在疾病情況下發(fā)生異常選擇性剪接的機制打下基礎(chǔ)。 研究方法： 1.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴增bcl-x基因組目的片段：用PCR方法從K562細(xì)胞基因組DNA中擴增出bcl-x基因外顯子2及內(nèi)含子2的5′端部分序列片段(P1P2)；另外還擴增出bcl-x基因內(nèi)含子2的3′端及外顯子3部分序列(P3P4)； 2.定向克隆的方法構(gòu)建微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x:首先將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 (-)和P1P2片段分別進(jìn)行Xbal和Xhol雙酶切反應(yīng),然后將雙酶切后的兩片段進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳并回收,用T4連接酶將兩片段連接起來,得到質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-P1P2,經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌、篩選陽性菌落、提取質(zhì)粒及雙酶切,測序鑒定所構(gòu)建的質(zhì)粒的正確性,經(jīng)鑒定無誤后再將質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-P1P2和P3P4片段分別進(jìn)行Xhol和EcoRI雙酶切反應(yīng),并將酶切后的片段進(jìn)行回收,同樣使用T4連接酶將兩片段連接起來,得到質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-P1P2-P3P4,即pcDNA3.1(-)-bcl-x,經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌、篩選陽性菌落、提取質(zhì)粒及雙酶切,測序鑒定所構(gòu)建的質(zhì)粒,即bcl-x微基因； 3.反向PCR法構(gòu)建bcl-x基因重要順式元件CRCE1、CRCE2、B2G的突變微基因：以鑒定無誤后的pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因為模板,通過設(shè)計致使順式元件CRCE1、CRCE2、B2G發(fā)生突變的引物,進(jìn)行反向PCR；然后用酶Dpnl對模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行消化,并使PCR產(chǎn)物產(chǎn)生自身環(huán)化反應(yīng),最后將環(huán)化后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌,篩選陽性菌落、提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測序鑒定。 4.RT-PCR監(jiān)測bcl-x微基因及其突變微基因在HL60細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄：將構(gòu)建好的bcl-x微基因及其突變微基因用脂質(zhì)體(lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時后用TRNzol提取細(xì)胞總RNA,并行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA,以cDNA為模板設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng),檢測細(xì)胞中bcl-xL/bcl-xS mRNA水平的變化。 研究結(jié)果： 1：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示：PCR反應(yīng)擴增出正確大小的bcl-x基因組片段(P1P2,P3P4); 2：經(jīng)酶切,測序?qū)嶒炶b定后,構(gòu)建的微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x中沒有發(fā)現(xiàn)錯誤的堿基突變；微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x瞬時轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后,能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄； 3:bcl-x微基因的突變體pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)經(jīng)酶切,測序鑒定沒有發(fā)現(xiàn)錯誤突變；每個突變微基因瞬時轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后,均能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄； 4:RT-PCR實驗表明：bcl-x微基因轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后bcl-xL/bcl-xS為1.4, bcl-x基因順式作用元件B2G、CRCE1、CRCE2對bcl-xL/bcl-xS有一定影響,pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后,RT-PCR電泳結(jié)果顯示bcl-xS幾乎消失；pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后,RT-PCR電泳結(jié)果顯示bcl-xL/bcl-xS為1.6。 結(jié)論： 1.成功地擴增出包含bcl-xS, bcl-xL剪接位點及其可能的調(diào)控元件的bcl-x基因組片段：P1P2,P3P4； 2.定向克隆的方法成功地構(gòu)建出人類凋亡相關(guān)基因bcl-x的微基因；反向PCR方法成功地構(gòu)建出bcl-x相關(guān)順式作用元件的突變微基因：pcDNA3.1 (-)-bcl-x-B2G(M)、pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE 1(M)、pcDNA3.1 (-)-bcl-x-CRCE2(M); 3.bcl-x微基因及其突變微基因均能在HL60細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,并且bcl-xL/bcl-xS mRNA的比值受順式元件B2G、CRCE1、CRCE2的影響：順式作用元件B2G缺失和CRCE1突變使bcl-xS幾乎消失,CRCE2突變也使bcl-xL/bcl-xS比值上升。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Regulation of alternative splicing of Bcl-x by IL-6,GM-CSF and TPA[J];Cell Research;2004年06期

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本文編號：1491423