發(fā)布時(shí)間：2018-01-18 12:02

  本文關(guān)鍵詞：猴腦紋狀體邊緣區(qū)腦啡肽樣免疫反應(yīng)陽(yáng)性突觸的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景： 學(xué)習(xí)和記憶是中樞神經(jīng)系統(tǒng)高級(jí)活動(dòng)的一種方式,是高等動(dòng)物和人類(lèi)認(rèn)知的基礎(chǔ),也是動(dòng)物賴(lài)以生存和進(jìn)化發(fā)展的關(guān)鍵。學(xué)習(xí)是對(duì)新信息和新知識(shí)獲取的神經(jīng)過(guò)程,而記憶則是對(duì)所獲取信息的保存和“讀出”的神經(jīng)過(guò)程。學(xué)習(xí)和記憶是相互聯(lián)系的、不可分割的兩個(gè)過(guò)程。學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性,包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、神經(jīng)環(huán)路及突觸連接等不同水平的可塑性,其中突觸可塑性尤為重要。突觸可塑性是指突觸在一定條件下調(diào)整功能、改變形態(tài)和增減數(shù)目的能力,包括突觸傳遞效能和突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。其變化主要有：(1)突觸前修飾,包括神經(jīng)遞質(zhì)的合成、貯存、釋放及自身受體功能的改變；(2)突觸后修飾,包括受體激活第二信使、G蛋白、膜離子流及磷酸化和脫磷酸化等各種變化；(3)突觸前或突觸后結(jié)構(gòu)的可塑性,包括突觸界面曲率、突觸后致密物質(zhì)、樹(shù)突棘等的變化；(4)非神經(jīng)元的修復(fù)。突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式—長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(Long-term depression LTD)現(xiàn)象已被公認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)細(xì)胞水平的生物學(xué)基礎(chǔ)。LTP首先在哺乳動(dòng)物的海馬(CA1區(qū))和齒狀回被觀(guān)察到,是指突觸前神經(jīng)元受到短時(shí)間的快速重復(fù)刺激后,在突觸后神經(jīng)元快速形成的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的興奮性突觸后電位增強(qiáng),表現(xiàn)為潛伏期縮短、幅度增高、斜率加大。LTP的產(chǎn)生機(jī)制可分成三個(gè)階段：誘導(dǎo)階段,即誘導(dǎo)產(chǎn)生LTP；表達(dá)階段,即LTP最初出現(xiàn)的時(shí)期,持續(xù)幾分鐘到幾小時(shí)；維持階段,即增強(qiáng)的反應(yīng)繼續(xù)表達(dá)的長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)階段。 阿片肽主要有3種,腦啡肽、內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽,其中腦啡肽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最高的內(nèi)源性阿片肽,與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系極為密切。1975年,Hughes等首次從豬腦中提取并發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性阿片樣物質(zhì),隨后又純化并研究確定此類(lèi)阿片樣物質(zhì)包含兩種五肽,甲硫氨酸腦啡肽(Methionine enkephalin, MET-ENK)和亮氨酸-腦啡肽((Leucine-enkephalin, LEU-ENK))。大量研究發(fā)現(xiàn)腦啡肽與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。Kastin等首次報(bào)道腹腔注射MET-ENK可提高大鼠復(fù)雜迷宮實(shí)驗(yàn)記憶的保持。MartinezJ等研究發(fā)現(xiàn)LEU-ENK類(lèi)似物DADLE增強(qiáng)大鼠被動(dòng)回避反應(yīng)的習(xí)得,而損害小鼠趨食Y-迷宮記憶的保持階段。Henk Rigter等發(fā)現(xiàn)外周注射LEU-ENK或MET-ENK均可減輕二氧化碳誘導(dǎo)所致的實(shí)驗(yàn)性健忘。腹腔注射LEU-ENK (400ug/kg)或其類(lèi)似物D-Ala-D亮氨酸-腦啡肽(4ug/kg)均會(huì)損害大鼠的主動(dòng)逃避反應(yīng)的獲得。Sweis等發(fā)現(xiàn)慢性壓力致記憶損害輕的大鼠較記憶損害嚴(yán)重的大鼠腦腦啡肽表達(dá)明顯上調(diào),認(rèn)為腦啡肽有希望作為減輕慢性壓力導(dǎo)致的記憶損害的干預(yù)靶點(diǎn)。MeilandtwJ等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠內(nèi)嗅皮層和齒狀回的MET-ENK明顯升高,并推測(cè)腦啡肽的升高可能對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠、甚至阿爾茨海默病人的認(rèn)知有損害作用。 自從1957年Scoville報(bào)道了一位雙側(cè)顳葉切除的病人出現(xiàn)了嚴(yán)重的近期記憶喪失,至此Lashley的學(xué)習(xí)記憶彌漫地儲(chǔ)存在腦內(nèi)學(xué)說(shuō)的統(tǒng)治地位逐漸崩析瓦解。50多年來(lái)對(duì)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的研究發(fā)現(xiàn),不同學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)在不同的學(xué)習(xí)記憶類(lèi)型中扮演著不同的角色。目前認(rèn)為與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要腦區(qū)包括海馬、前額葉皮層、小腦、杏仁體、Meyne-基底核和大腦皮層等。損害內(nèi)側(cè)顳葉記憶系統(tǒng)(由海馬及相鄰有關(guān)皮層等構(gòu)成)可導(dǎo)致順行性和逆行性遺忘。前額葉皮層與工作記憶密切相關(guān),主要包括3個(gè)神經(jīng)環(huán)路,其中背外側(cè)前額葉環(huán)路介導(dǎo)執(zhí)行行為、眶額環(huán)路介導(dǎo)社會(huì)行為、內(nèi)額葉環(huán)路參與動(dòng)機(jī)的形成。小腦在運(yùn)動(dòng)技巧的學(xué)習(xí)和空間認(rèn)知活動(dòng)中起重要作用。早期學(xué)習(xí)記憶功能障礙幾乎均責(zé)之于大腦皮質(zhì),但隨著許多病位不在大腦皮質(zhì)的疾病如亨廷頓病(Huntingtong's disease, HD)和帕金森病(Parkinson's disease,PD)也同樣出現(xiàn)記憶障礙,提示皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)也可能是一些高級(jí)認(rèn)知功能的重要神經(jīng)基礎(chǔ)。隨后發(fā)現(xiàn)杏仁核病變會(huì)阻斷動(dòng)人或動(dòng)物新的條件反射形成或舊的條件恐懼反射的表達(dá)。Meynet基底核參與了Alzheimer病的形成,是Alzheimer病肯定的損害。 紋狀體邊緣區(qū)(the marginal division, MrD)是新近發(fā)現(xiàn)的恰好位于大腦幾個(gè)已知學(xué)習(xí)記憶結(jié)構(gòu)(間腦、海馬、新皮層)中心的一個(gè)皮質(zhì)下學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)。1988年舒斯云等用生物凝集素標(biāo)記法和免疫辣根過(guò)氧化物酶染色法在大鼠腦內(nèi)新紋狀體尾內(nèi)側(cè)邊緣、包繞蒼白球外側(cè)的位置,新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由密集梭形細(xì)胞組成的帶狀結(jié)構(gòu),其細(xì)胞形態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)含量和超微結(jié)構(gòu)等都與紋狀體其他部分很不相同,后又相繼在貓、猴和人腦內(nèi)相應(yīng)部位發(fā)現(xiàn)MrD的存在,證明MrD是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)普遍存在的結(jié)構(gòu),且動(dòng)物越高級(jí)MrD越發(fā)達(dá)。用免疫組化染色法發(fā)現(xiàn)大鼠腦紋狀體MrD內(nèi)腦啡肽、強(qiáng)啡肽B和、P物質(zhì)(substance P, SP)免疫反應(yīng)陽(yáng)性終末和含鋅纖維比紋狀體其他部位多,還富含N-甲基-D-門(mén)冬氨酸(NMDA)受體、蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)、鈣神經(jīng)素、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)等多種學(xué)習(xí)記憶相關(guān)物質(zhì)。紋狀體MrD的傳入纖維主要來(lái)自黑質(zhì)外側(cè)及背外側(cè)部,發(fā)出的纖維投射到Meynet基底核和黑質(zhì)等處。用分子生物學(xué)和免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)紋狀體MrD是邊緣系統(tǒng)新的組成部分。該區(qū)與腦內(nèi)包括海馬、杏仁核、Meynet氏基底核和前額葉皮質(zhì)等多個(gè)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)存在著結(jié)構(gòu)和或功能上的聯(lián)系,大鼠雙側(cè)MrD化學(xué)性損毀后行雙盲Y迷宮試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶功能障礙,對(duì)健康人和紋狀體MrD損害病人進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試和腦部功能核磁共振研究均證明了MrD有學(xué)習(xí)記憶功能,MrD參與了聽(tīng)覺(jué)數(shù)字工作記憶、中文配對(duì)詞語(yǔ)聯(lián)想學(xué)習(xí)記憶、中英文書(shū)寫(xiě)、數(shù)字計(jì)算和空間記憶的腦功能活動(dòng)。 基于以上理論,本研究擬對(duì)成年雄性恒河猴常規(guī)灌注固定和取腦,冰凍切片后行免疫組織化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)紋狀體MET-ENK的表達(dá),然后取紋狀體MrD內(nèi)免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)進(jìn)行超微切片,電鏡下觀(guān)察MrD內(nèi)MET-ENK樣免疫反應(yīng)神經(jīng)終末突觸的超微結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步探索紋狀體MrD的學(xué)習(xí)記憶功能提供超微結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 研究目的： 1、通過(guò)解剖形態(tài)學(xué)觀(guān)察猴紋狀體MrD在位置和形態(tài)特征。 2、免疫組織化學(xué)后行葡萄糖氧化酶-二氨基聯(lián)苯胺-硫酸鎳銨染色,電鏡下觀(guān)察紋狀體MrD學(xué)習(xí)記憶相關(guān)物質(zhì)MET-ENK樣免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)終末的超微結(jié)構(gòu),進(jìn)一步了解學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)-紋狀體MrD的超微結(jié)構(gòu)研究,為學(xué)習(xí)記憶提供超微結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),為以后研究學(xué)習(xí)記憶障礙相關(guān)疾病的診斷治療提供新思路。 實(shí)驗(yàn)方法： 將6只雄性恒河猴用戊巴比妥麻醉,生理鹽水經(jīng)心臟灌注后,用含有40g/L多聚甲醛、1g/l戊二醛和2g/L苦味酸的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液固定灌注,將腦取出,浸泡至40g/L的多聚甲醛中,置4℃冰箱中固定28h。在恒冷箱切片機(jī)上將猴腦組織塊切片至50u m厚度,將腦組織浸入含20%蔗糖的磷酸緩沖液使腦組織沉底。用磷酸緩沖液沖洗后置入稀釋1：3000的抗MET-ENK兔血清中,在4℃孵育36h。在用磷酸緩沖液稀釋的生物素結(jié)合的羊抗兔IgG室溫下孵育12h。在抗生物素-卵白素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(Vector ABC kit)進(jìn)行免疫反應(yīng),室溫孵育4h,用葡萄糖氧化酶-二氨基聯(lián)苯胺-硫酸鎳銨(GDN)方法顯示免疫反應(yīng)物。MET-ENK陽(yáng)性切片在1%戊二醛中固定30min,磷酸緩沖液漂洗后,置于1%鋨酸中固定30min。經(jīng)梯度酒精脫水后在環(huán)氧丙烷中脫水,在EPON816中室溫過(guò)夜。將切片置于涂有Teflon的兩塊硅化玻璃載片之間,在37℃、45℃及60℃各聚合一天。在光鏡下觀(guān)察含密集的MET-ENK神經(jīng)終末的MrD,并在體視鏡下切取該區(qū),用Cyanoacrylate膠粘在EPON塊尖端,超薄切片機(jī)切片,1%枸櫞酸鉛染色,JEOL-2000EX電鏡觀(guān)察。 結(jié)果： 1、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)恒河猴腦紋狀體MET-ENK的表達(dá) 光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)殼核染色淺,蒼白球外節(jié)內(nèi)大量MET-ENK陽(yáng)性表達(dá)物質(zhì),染色呈濃黑斑塊狀,蒼白球內(nèi)節(jié)幾乎未見(jiàn)MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)分布,呈白色。在殼核和蒼白球之間有一條密集排列的MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞帶,沿與殼核內(nèi)側(cè)邊界平行方向走行,其染色比蒼白球外節(jié)淺,但較殼核其他部位深,呈明顯的紫藍(lán)色免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物條帶,在免疫反應(yīng)陽(yáng)性帶中,含有散在的梭型的免疫陽(yáng)性細(xì)胞,此區(qū)即恒河猴紋狀體MrD(圖1)。 2、電鏡觀(guān)察恒河猴紋狀體MrD的超微結(jié)構(gòu) 電鏡下可見(jiàn)MrD神經(jīng)元為長(zhǎng)梭形或紡錘形,核大呈卵圓形常居中、染色淺,核周體細(xì)胞器較少、色淡,有少量線(xiàn)粒體、核糖體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不均勻地散布在胞漿中,核仁明顯,細(xì)胞核透亮度好,箭頭所示為胞體左側(cè)有幾個(gè)MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性軸突和胞體形成軸-體突觸(圖2)。 電鏡下MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性樹(shù)突、軸突、胞體、樹(shù)突棘主要形成5個(gè)類(lèi)型的突觸連接。 (1)軸-樹(shù)突觸 MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性軸突終末與樹(shù)突主要形成對(duì)稱(chēng)性突觸(圖3A),軸突終末內(nèi)多為中等大小橢圓形或多形性囊泡,�？梢�(jiàn)線(xiàn)粒體存在。也可見(jiàn)1個(gè)陽(yáng)性軸突與2個(gè)或以上樹(shù)突形成復(fù)合型對(duì)稱(chēng)性突觸(圖3B)。偶可見(jiàn)1個(gè)軸突終末在1個(gè)樹(shù)突干斷面形成2個(gè)甚至以上突觸活性點(diǎn)(圖3C)。 (2)軸-棘突觸 觀(guān)察到的MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性軸突與樹(shù)突棘形成軸-棘突觸,軸-棘突觸均為非對(duì)稱(chēng)性突觸(圖4),軸突終末內(nèi)多含有小或中等大小圓形清亮突觸囊泡。MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)軸突終末與多個(gè)樹(shù)突棘形成復(fù)合型非對(duì)稱(chēng)性突觸也很常見(jiàn)(圖4A)。還可觀(guān)察到MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性軸突終末與1個(gè)樹(shù)突棘形成2個(gè)非對(duì)稱(chēng)性突觸(圖4B)。 (3)軸-體突觸 MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性軸突終末與神經(jīng)元胞體可形成對(duì)稱(chēng)性軸-體突觸(圖5A),也可形成非對(duì)稱(chēng)性軸-體突觸(圖B)。 (4)軸-軸突觸 觀(guān)察到兩種類(lèi)型軸-軸突觸,其中一種突觸的2個(gè)軸突終末均含有MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì),軸突間形成2個(gè)突觸活性點(diǎn),同時(shí)它們還分別與1個(gè)未標(biāo)記神經(jīng)元胞體形成對(duì)稱(chēng)性軸-體突觸(圖6A)。另一種突觸的MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性軸突終末與2個(gè)未標(biāo)記的軸突終末均形成對(duì)稱(chēng)性軸-軸突觸(圖6B)。根據(jù)超微形態(tài)推測(cè),軸-軸突觸屬于抑制性突觸。 (5)復(fù)合型突觸 復(fù)合型突觸是指1個(gè)突觸結(jié)構(gòu)中包含有3個(gè)以上的神經(jīng)成分。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到紋狀體MrD存在大量復(fù)合型突觸。1個(gè)未標(biāo)記的樹(shù)突棘與1個(gè)MET-ENK免疫反應(yīng)軸突終末形成非對(duì)稱(chēng)性突觸,同時(shí),此MET-ENK免疫反應(yīng)軸突終末與1個(gè)未標(biāo)記的神經(jīng)元胞體也形成了非對(duì)稱(chēng)性突觸,即棘-軸-體復(fù)合型突觸(圖7A)。1個(gè)MET-ENK免疫反應(yīng)軸突終末分別與2個(gè)樹(shù)突和1個(gè)樹(shù)突棘形成的復(fù)合型突觸,且均為對(duì)稱(chēng)性突觸。(圖7B)復(fù)合型突觸顯示邊緣區(qū)功能的復(fù)雜性。 結(jié)論： 學(xué)習(xí)記憶新區(qū)-紋狀體MrD內(nèi)MET-ENK免疫反應(yīng)陽(yáng)性軸突終末突觸具有多樣性和復(fù)雜性,主要有軸-樹(shù)突觸、軸-棘突觸、軸-體突觸、軸-軸突觸以及多種復(fù)合型突觸。MrD與紋狀體其他區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮不同的作用,可能與其超微結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。紋狀體MrD內(nèi)ENK及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1440843