本文關(guān)鍵詞：抗菌肽PR39靶向巨噬細(xì)胞表達(dá)抗胞內(nèi)菌感染研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 研究背景: 感染性疾病,尤其是慢性持續(xù)性感染疾病,是危害動(dòng)物和人類健康與生命的全球性頑疾之一。其中許多難治且危害嚴(yán)重的感染(如結(jié)核、病毒性肝炎等)均與細(xì)胞內(nèi)微生物感染有關(guān)。常見(jiàn)的胞內(nèi)感染細(xì)菌主要有:結(jié)核桿菌、傷寒沙門氏菌、嗜肺軍團(tuán)菌、麻風(fēng)桿菌等。這些胞內(nèi)感染菌進(jìn)入人體后,能以不同方式逃避巨噬細(xì)胞的殺滅并在細(xì)胞內(nèi)生存、繁殖,還能夠逃避體液免疫和抗生素的殺滅作用,使巨噬細(xì)胞反而成為庇護(hù)所,導(dǎo)致臨床治療困難。 抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)是一類具有抗菌活性的多肽,是動(dòng)物和植物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的對(duì)抗病原體致病作用的防御性肽類活性物質(zhì),在生物體的天然免疫中起著重要的作用�？咕木哂袕V譜、高效的抗菌活性,與其他抗菌藥物不易產(chǎn)生交叉耐藥性,而且不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生。抗菌肽PR39是最初從豬小腸中分離純化出的一種富含脯氨酸的抗菌肽,是抗菌肽cathelicidin家族中的一員。抗菌肽PR39對(duì)細(xì)菌(如結(jié)核分支桿菌、傷寒沙門氏菌等)具有廣譜、高效的抗菌作用。除了抗菌作用以外,PR39還具有中和內(nèi)毒素、抗炎、免疫誘導(dǎo)、組織修復(fù)、抑制凋亡等功能。所以與傳統(tǒng)抗生素相比,PR39在細(xì)菌感染的治療中,具有多方面優(yōu)勢(shì),有望成為治療胞內(nèi)細(xì)菌感染的新一代抗菌藥。 然而,抗菌肽在臨床實(shí)際應(yīng)用中仍面臨著很多問(wèn)題:①天然抗菌肽分離純化困難,成本較高,患者不易承受。②作為多肽,口服易被消化破壞,只能靜脈或肌注給藥,應(yīng)用不便,并可能引起過(guò)敏反應(yīng)。③容易降解,需要持續(xù)給藥。④同其他普通抗生素一樣,抗菌肽不易在細(xì)胞內(nèi)富集,從而難以發(fā)揮其對(duì)胞內(nèi)菌的抗菌作用。因此PR39和其他抗菌肽的臨床應(yīng)用,特別是在胞內(nèi)菌感染治療中受到了較大限制。而尋找合理、有效、方便而且經(jīng)濟(jì)的治療方式,成為PR39等新型高效抗菌肽應(yīng)用于胞內(nèi)菌感染治療的關(guān)鍵問(wèn)題。 研究目的: 構(gòu)建攜帶巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子及抗菌肽PR39基因的重組腺病毒(Ad-SP-PR39),靶向巨噬細(xì)胞高效表達(dá)抗菌肽PR39基因。從體外細(xì)胞水平和體內(nèi)活體水平檢測(cè)目的基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)及基因表達(dá)的靶向性,并進(jìn)一步研究該重組腺病毒在體內(nèi)外抗胞內(nèi)菌感染的作用。為抗菌肽PR39在胞內(nèi)微生物感染基因治療中的合理安全應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法: 1.采用拼接PCR方法合成抗菌肽PR39基因,經(jīng)NheI和SalI雙酶切后克隆入pIRES2-GFP載體,導(dǎo)入小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7,篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。通過(guò)熒光顯微鏡、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測(cè)抗菌肽PR39基因在小鼠巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況。采用平板活菌技術(shù)方法,檢測(cè)攜抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在體外殺滅胞內(nèi)菌、抵抗胞內(nèi)菌感染的能力。 2.抗菌肽PR39多克隆抗體的制備:利用蛋白抗原決定簇預(yù)測(cè)軟件DNASTAR,預(yù)測(cè)抗菌肽PR39的抗原決定簇序列,用化學(xué)合成法合成其抗原決定簇序列。合成的多肽與KLH偶聯(lián)、純化后免疫家兔。制備的抗血清經(jīng)鹽析純化后用SDS-PAGE和ELISA方法進(jìn)行抗體的純度和滴度測(cè)定。 3.抗菌肽PR39原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá):根據(jù)Genbank中抗菌肽PR39序列和大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性,設(shè)計(jì)并合成PR39序列的拼接PCR引物,通過(guò)拼接PCR擴(kuò)增合成PR39 DNA序列�？寺〉絧ET-32a(+)、pET28a、pQE30、pET31b等原核表達(dá)載體。在以上載體的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步構(gòu)建了一系列PR39基因的串聯(lián)表達(dá)載體。并對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。 4.根據(jù)GenBank中巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列,設(shè)計(jì)并合成其拼接引物,通過(guò)PCR方法拼接合成巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列。克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中,替換其中的CMV啟動(dòng)子,得到重組質(zhì)粒pSP-GFP。將質(zhì)粒pSP-GFP和pERFP-N1等摩爾濃度混合,用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo、人肝癌細(xì)胞株HepG2、人乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-30和非洲綠猴腎細(xì)胞株COS-7。轉(zhuǎn)染48h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達(dá)并計(jì)數(shù)。 5.構(gòu)建由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的PR39基因穿梭質(zhì)粒;將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BJ5183,制備AdEasier Cell并鑒定。將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)AdEasier Cell,通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定。將腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,包裝出重組腺病毒Ad-SP-PR39,并擴(kuò)增和純化。用重組腺病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)目的基因的表達(dá)。并檢測(cè)Ad-SP-PR39在各種細(xì)胞中表達(dá)目的基因的靶向性。 6.用重組腺病毒Ad-SP-PR39體外感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,用平板活菌計(jì)數(shù)方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物對(duì)傷寒桿菌和減毒牛型結(jié)核分支桿菌(BCG)的殺菌作用。將重組腺病毒經(jīng)氣管感染C57BL/6小鼠肺部,肺組織冰凍切片,熒光顯微鏡觀察腺病毒在肺部的定位及存活情況;采用RT-PCR和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)目的基因的表達(dá)及定位情況。C57BL/6小鼠經(jīng)氣管感染BCG,感染細(xì)菌后再經(jīng)氣管感染重組腺病毒Ad-SP-PR39,并檢測(cè)腺病毒的表達(dá)產(chǎn)物PR39體內(nèi)對(duì)減毒牛型結(jié)核分枝桿菌BCG的殺滅效果。 研究結(jié)果: 1.用拼接PCR成功擴(kuò)增出抗菌肽PR39基因,并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pIRES2-PR39,體外轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后,篩選出了目的基因的穩(wěn)定表達(dá)株。在細(xì)胞中檢測(cè)到目的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)。表達(dá)抗菌肽PR39的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的裂解產(chǎn)物具有較強(qiáng)抗菌作用;攜抗菌肽PR39的巨噬細(xì)胞體外殺滅胞內(nèi)傷寒桿菌的能力增強(qiáng)。 2.成功制備了家兔抗PR39多克隆抗體,抗體經(jīng)鹽析純化后進(jìn)行SDS-PAGE,電泳結(jié)果顯示制備的抗體純度較高。進(jìn)一步用ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià),效價(jià)達(dá)1:10 000。 3.成功構(gòu)建了抗菌肽PR39基因的多種原核表達(dá)載體,反復(fù)嘗試了目的基因的單獨(dú)表達(dá)、串連表達(dá)、與Trx或KSI融合表達(dá)、融合后串連表達(dá)等多種表達(dá)模式,并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行多方面優(yōu)化。但是,由于抗菌肽PR39特殊的抗菌機(jī)制和強(qiáng)烈的抗菌活性,導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量極低甚至幾乎不表達(dá),最終無(wú)法得到大量的目的蛋白。 4.采用拼接PCR方法成功合成了巨噬細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子序列,構(gòu)建了由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的綠色熒光蛋白(GFP)真核表達(dá)載體pSP-GFP。質(zhì)粒pSP-GFP和紅色熒光蛋白(RFP)真核表達(dá)載體pERFP-N1按1:1混合后,轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞和多種非巨噬細(xì)胞。GFP和RFP在不同細(xì)胞中的表達(dá)具有差異,由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因僅在巨噬細(xì)胞中高效表達(dá),而在非巨噬細(xì)胞中則幾乎沒(méi)有表達(dá)。而以CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的RFP基因則在巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞中均有相近的高表達(dá)。 5.構(gòu)建了攜巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子及PR39基因的穿梭質(zhì)粒和AdEasier Cell。利用細(xì)菌內(nèi)同源重組原理,成功構(gòu)建成由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的PR39腺病毒表達(dá)載體(Ad-SP-PR39)。重組腺病毒經(jīng)擴(kuò)增純化后感染小鼠巨噬細(xì)胞,能夠有效表達(dá)目的基因。Ad-SP-PR39能夠靶向巨噬細(xì)胞有效表達(dá)目的基因。 6.重組腺病毒Ad-SP-PR39體外感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后,其表達(dá)的抗菌肽PR39能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)傷寒桿菌和減毒牛型結(jié)核分支桿菌(BCG)的殺菌作用。重組腺病毒經(jīng)氣管感染C57BL/6小鼠肺部后,能夠有效定位到肺部,并能表達(dá)目的基因;采用RT-PCR和免疫熒光技術(shù)可以檢測(cè)目的基因的表達(dá)。C57BL/6小鼠經(jīng)氣管感染重組腺病毒Ad-SP-PR39后,PR39基因表達(dá)產(chǎn)物能夠有效殺滅小鼠肺部的減毒牛型結(jié)核分支桿菌BCG。 研究結(jié)論: 1.攜抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7能有效表達(dá)抗菌肽PR39,表達(dá)產(chǎn)物能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞體外殺滅胞內(nèi)傷寒桿菌的能力。 2.成功制備了抗菌肽PR39多克隆抗體。 3.由于抗菌肽PR39特殊的抗菌機(jī)制和強(qiáng)烈的抗菌活性,目前尚無(wú)法通過(guò)原核表達(dá)的方式得到大量的目的蛋白。 4.由巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因能夠靶向巨噬細(xì)胞高效表達(dá)。為抗菌肽PR39基因的靶向性表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 5.重組腺病毒Ad-SP-PR39能夠有效感染小鼠巨噬細(xì)胞并表達(dá)目的基因,而且目的基因的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞具有靶向性。 6.重組腺病毒Ad-SP-PR39能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞體外殺滅傷寒桿菌和體內(nèi)外殺滅減毒牛型結(jié)核分支桿菌的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 伊正君;朱道銀;李俊明;何永林;楊健;李娜;;人顆粒溶素與EGFP基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建及其在鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中的表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年23期

2 周義文;生物抗菌肽研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2004年02期

3 顧覺(jué)奮,何文杰;Lantibiotic:一類新穎的抗菌肽研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè));2001年06期

4 韋巖;;抗菌肽的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用[J];菏澤醫(yī)學(xué)�？茖W(xué)校學(xué)報(bào);2007年01期

5 王瓊,何清君;植物抗菌肽研究進(jìn)展[J];四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年02期

6 曾輝明,黃俊生,程立生;昆蟲(chóng)抗菌肽的研究進(jìn)展[J];熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué);2002年06期

7 羅剛,魏泓;哺乳動(dòng)物抗菌肽研究進(jìn)展[J];四川動(dòng)物;2002年04期

8 康翠潔,王金星,趙小凡,相建海;中國(guó)對(duì)蝦抗菌肽成熟肽的cDNA克隆[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2002年06期

9 王輝;楊桂文;吳敬濤;安利國(guó);;抗菌肽作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J];濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年01期

10 張希春,孫振鈞,禚如朋,侯全民,林桂秋;蚯蚓兩種抗菌肽的分離純化及部分性質(zhì)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2002年06期

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