發(fā)布時間：2018-01-18 08:17

  本文關鍵詞：治療用抗人T淋巴細胞CD25單克隆抗體（WuTac）的工藝研究及其雜質(zhì)鑒定　出處：《武漢生物制品研究所》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： WuTac 疏水層析 聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜 流式細胞術 雙向電泳 質(zhì)譜 等電點 純度 效價 親和常數(shù)

【摘要】： 治療用鼠抗人T淋巴細胞CD25單克隆抗體(WuTac),以下簡稱WuTac,是武漢生物制品研究所自主研發(fā)的用以預防臨床腎移植排斥反應的單抗制品,目前已完成Ⅰ期臨床研究,正在進行Ⅱ期臨床研究。為了進一步提高制品的安全性和有效性,本實驗論文對該單抗制品的中試生產(chǎn)工藝進行了優(yōu)化和驗證,并對純化后的產(chǎn)品進行了雜質(zhì)分析和鑒定。 針對WuTac純化工藝中的疏水層析步驟,以流動相為研究對象,對其鹽種類、鹽濃度和梯度層析條件進行摸索從而初步確定中試放大的疏水層析條件:吸附條件為1.0M氯化鈉+20 mM PB(pH 7.4),流速為10 ml/min;洗脫條件為20 mM PB(pH7.4),20 ml/min。WuTac腹水經(jīng)辛酸硫酸銨沉淀法聯(lián)合疏水層析純化后,采用SDS-PAGE法和HPLC法對純化后的產(chǎn)品進行純度鑒定:SDS-PAGE掃描純度達到100%,HPLC單體含量達到100%。采用流式細胞術(FCM)對其效價進行鑒定,效價不小于1:10000。采用SDS-PAGE聯(lián)合質(zhì)譜法對疏水層析去除的雜蛋白(分子量介于130-170kD)進行分析,雜蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為小鼠血漿銅藍蛋白。采用雙向電泳法聯(lián)合質(zhì)譜法對疏水層析純化后的產(chǎn)品進行雜質(zhì)分析,質(zhì)譜分析結(jié)果表明,雙向電泳結(jié)果中除抗體重、輕鏈外的雜蛋白為小鼠的抗體片段。利用等電聚焦(IEF)測定其等電點(pI)為5.65～5.94。利用生物傳感器(BIAcore 3000)測定WuTac疏水層析(HIC)前、后的親和常數(shù), KA分別為5.85×1010 L/mol和3.49×1011 L/mol。 本論文初步確定了WuTac中試生產(chǎn)工藝中疏水層析步驟的條件。疏水層析法能夠去除WuTac制品中的二聚體、多聚體以及小鼠血漿銅藍蛋白。經(jīng)疏水層析精純后的WuTac制品純度高,除小鼠抗體片段外無其它鼠源性雜蛋白。為制定和完善該產(chǎn)品的質(zhì)量控制體系提供了實驗依據(jù)。
[Abstract]:CD25 monoclonal antibody against human T lymphocytes (WuTac) was used for treatment. Wuhan Institute of Biological products (Wuhan Institute of Biological products) has developed a monoclonal antibody to prevent renal allograft rejection. At present, we have completed phase I clinical research. In order to further improve the safety and effectiveness of the product, the pilot-scale production process of the McAb was optimized and verified in this paper. The impurity of the purified product was analyzed and identified. According to the hydrophobic chromatography in the purification process of WuTac, the mobile phase was used as the research object, and the salt species were analyzed. Salt concentration and gradient chromatography conditions were explored to determine the hydrophobic chromatography conditions of the pilot scale up: the adsorption condition was 1.0m NaCl 20mm PB(pH 7.4). The flow rate was 10 ml / min; The elution conditions were as follows: (1) the pH value of 20 mm PBL was 7. 4% and 20 ml/min.WuTac. The ascites were purified by ammonium octanoate sulfate precipitation and hydrophobic chromatography. The purity of purified product was identified by SDS-PAGE and HPLC. The scanning purity of the purified product was 100%. The content of HPLC monomer was 100%. Flow cytometry was used to identify its titer. The titer was not less than 1: 10000.The hetero proteins (molecular weight ranged from 130 to 170 KD) removed by hydrophobic chromatography were analyzed by SDS-PAGE combined with mass spectrometry. The hybrid protein was identified as mouse ceruloplasmin by mass spectrometry. The impurity of the purified product was analyzed by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The result of mass spectrometry showed that anti-body weight was removed from the result of two-dimensional electrophoresis. The heterologous protein outside the light chain is the antibody fragment of mice. The isoelectric point (Pi) determined by isoelectric focusing (IEF) is 5.65 ~ 5.94. BiAcore 3000 is used as biosensor. Before the determination of WuTac hydrophobic chromatography. The subsequent affinity constants were 5.85 脳 10 10 L / mol and 3.49 脳 10 11 L / mol, respectively. In this paper, the conditions of hydrophobic chromatography in the pilot-scale production of WuTac were determined. Hydrophobic chromatography can remove dimer from WuTac products. Polymers and mouse plasma ceruloplasmin. Purified by hydrophobic chromatography, WuTac products were of high purity. There were no other murine hybrids except mouse antibody fragments, which provided experimental basis for establishing and perfecting the quality control system of this product.
【學位授予單位】：武漢生物制品研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：1440171