發(fā)布時間：2018-01-18 07:16

  本文關鍵詞：人免疫缺陷性病毒基因重組脊髓灰質炎病毒疫苗的實驗研究　出處：《中南大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種傳染病,以破壞人體的免疫功能為致病特征,以性接觸、血液傳播為主,目前在全球的蔓延呈不斷擴大的趨勢。雖然藥物治療對一部分患者有效,但價格十分昂貴,且易復發(fā)、產生耐藥。而絕大部分患者在經濟落后的發(fā)展中國家,因此研制價格便宜、接種方便的有效HIV疫苗是當務之急。 目前研制的HIV疫苗種類很多,既有傳統(tǒng)的病毒病毒失活疫苗、減毒活疫苗,也有新型的核酸疫苗、合成肽鏈疫苗、病毒載體疫苗等,但在臨床試驗效果均不理想。原因可能與HIV的高度變異、致病機理尚不清楚、抗體滴度不高多種因素有關。鑒于艾滋病主要以粘膜途徑傳播為主,研制一種能刺激機體產生較強粘膜免疫能力的疫苗可能對預防HIV的傳播起重要作用。 脊髓灰質炎病毒(PV)是一類單股正鏈RNA病毒,具有自主的復制能力。減毒的Sabin株疫苗在防止脊髓灰質炎多年的防疫實踐中證實安全、有效,以口服途徑為主,有較好的粘膜免疫誘導功能。為此,本研究擬以減毒的脊灰病毒SabinⅠ為載體,以HIV中國主要流行病毒株的基因為抗原,研制一種有實際推廣價值的HIV疫苗。 首先以HIV-1CN54株gagpol基因的cDNA為模板,通過PCR反應獲得了gagprotease基因片段,并于其兩端帶上合適的酶切位點。將攜帶脊灰病毒cDNA的真核表達質粒載體通過酶切反應,將PV位于兩個單一酶切位點的結構基因部分片段予以切除,而后由酶連接反應將HIV-1的gagprotease抗原基因片段與PV的cDNA酶切后的粘性末端進行連接,并保持了正確的閱讀框架,經雙酶切反應證實被正確地定向插入了載體上。對培養(yǎng)的Hela細胞,將重組的表達載體與由真核表達載體反式提供的PV結構基因實行共轉染,實現缺陷性脊灰病毒的細胞內重新組裝,并在電子顯微鏡下觀察,發(fā)現細胞內有重組病毒產生。經顯微鏡下對轉染的細胞連續(xù)觀察48小時,未發(fā)現有明顯的細胞病變效應。由于此重組缺陷病毒不產生子代病毒,沒有傳染性,因而有較好的生物安全性。 對培養(yǎng)的人二倍體細胞進行擴大培養(yǎng),大規(guī)模生產重組病毒疫苗。采用蔗糖梯度離心法分離、純化病毒顆粒,后以RT-PCR、WesternBlot對其進行鑒定,證實該病毒基因組帶有抗原基因,殼蛋白呈典型的PV結構。使其對Hela細胞進行感染性、表達檢測,發(fā)現能在細胞內正確表達抗原基因。 本實驗另將HIV-1gagprotease基因插入了真核表達載體的多克隆位點上,制備了一個DNA疫苗,并采用脂質體技術轉染細胞,以免疫熒光技術證實它能在細胞內有HIV抗原蛋白產生。 在隨機分配的脊灰受體轉基因小鼠身上,以研制的兩種疫苗分別隔月進行了三次經鼻腔粘膜免疫接種,以ELISA法檢測IgG、IgA體液免疫反應,以乳酸脫氫酶釋放試驗檢測淋巴細胞免疫效應,結果顯示重組的脊灰病毒疫苗整體誘導的免疫效果均DNA疫苗要好,部分結果相比差異有統(tǒng)計學意義,且差異顯著;部分差異不太明顯。此結果可能與其感染性較強、能在細胞能多次復制表達抗原能力較高相關。未發(fā)現疫苗有明顯的毒性作用。 結論:HIV抗原基因重組的缺陷性脊髓灰質炎疫苗有較好的免疫原性,對預防艾滋病的傳播應有較好的應用前景。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1440001