本文關(guān)鍵詞：HIV-Tat蛋白和人源性抗Tat單鏈抗體的制備及其生物活性研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus ,HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)的病原體。HIV-1編碼3個結(jié)構(gòu)基因和6個調(diào)節(jié)基因,Tat是其中的正調(diào)控蛋白。在沒有Tat的情況下,整合的前病毒基因組轉(zhuǎn)錄不完全,只有短的轉(zhuǎn)錄物生成。細(xì)胞質(zhì)中的Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核,與病毒新生RNA的長末端重復(fù)序列(Long Terminal Repeat,LTR)的反式激活效應(yīng)元件(transactivating responsive element , TAR)相互作用,反式激活病毒RNA的轉(zhuǎn)錄,使得轉(zhuǎn)錄得以持續(xù)進(jìn)行下去,生成完整的mRNA。Tat蛋白還可以分泌到感染的細(xì)胞外,發(fā)揮旁分泌、促細(xì)胞生長、免疫抑制及內(nèi)化等多方面的效用。Tat蛋白對多種細(xì)胞表現(xiàn)出來的這些生物學(xué)效應(yīng),直接或間接地導(dǎo)致了艾滋病各種并發(fā)癥,如Kaposi’s肉瘤、艾滋病癡呆(AIDS dementia)以及增加艾滋病患者患癌的可能性等。所以針對Tat蛋白的研究已經(jīng)成為治療AIDS的一個新靶點。 早期的研究大多使用抗Tat蛋白單克隆抗體(mAbs)以阻斷Tat的表達(dá),抑制Tat的生物學(xué)活性,從而控制疾病的進(jìn)展。但由于鼠源性單克隆抗體在人體多次使用后可產(chǎn)生人抗鼠抗體(Human Anti-Mouse Antibody,HAMA)反應(yīng),從而限制了其臨床使用。單鏈抗體(single-chain Fv,scFv)的出現(xiàn)明顯降低了HAMA反應(yīng),并具有分子量小,實體組織穿透力強,血漿半衰期短等優(yōu)點。我們通過基因工程方法制備了Tat融合蛋白,并利用Tomlison(I+J)半合成噬菌體抗體庫篩選出人源性抗Tat蛋白的單鏈抗體,檢測出Tat蛋白的部分免疫學(xué)和生物學(xué)活性,同時也觀察到在細(xì)胞外應(yīng)用抗Tat蛋白scFv抑制了Tat蛋白的生物學(xué)效用,為進(jìn)一步研究通過中和Tat蛋白來抑制HIV復(fù)制奠定基礎(chǔ)。 本文利用人工合成方法合成Tat基因,將該基因連接到PET-32a載體中,構(gòu)建PET-32a-Tat重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.Coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,得到表達(dá)Tat融合蛋白的工程菌,并成功誘導(dǎo)該菌表達(dá)出Tat融合蛋白。經(jīng)過系列純化過程,獲得了純度在95%以上的Tat融合蛋白。 利用Tomlinson (I + J)半合成噬菌體抗體庫篩選人源性抗Tat蛋白scFv。根據(jù)Tat蛋白的Basic保守區(qū)域合成一段短肽(RKKRRQRRR),以此合成短肽為抗原,按照常規(guī)程序進(jìn)行特異性抗Tat蛋白scFv篩選。經(jīng)4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”,獲得了1株能與Tat蛋白特異性結(jié)合的陽性克隆,PCR鑒定其有完整的插入片段,經(jīng)基因序列測定并檢索kabat數(shù)據(jù)庫,確定所克隆的scFv的輕、重鏈可變區(qū)分別屬于VκⅠ型、VHⅢ型。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的scFv蛋白,主要以分泌型抗體形式存在。對其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,分析其最佳表達(dá)條件為:1mmol/L IPTG,30℃,pH7.2 ,誘導(dǎo)24h,有利于scFv蛋白的大量表達(dá)。 采用不同層析方法對細(xì)菌分泌的scFv進(jìn)行純化,最后我們選擇了以下純化路線:蛋白首先經(jīng)鹽析初步純化,然后經(jīng)葡萄球菌蛋白A親和層析,再經(jīng)過Chelating-Cu金屬鏊和層析進(jìn)一步純化。最后,利用透析方法去除目的蛋白中的鹽。結(jié)果表明,該方法可以使目的蛋白得到非常好的純化。 對純化的抗Tat蛋白scFv進(jìn)行ELISA檢測表明,scFv蛋白具有與Tat結(jié)合的特性。Western blotting實驗表明,scFv能與本實驗室自制的Tat融合蛋白特異性結(jié)合。免疫細(xì)胞化學(xué)實驗表明,Tat蛋白可以主動進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),存在于細(xì)胞膜與細(xì)胞核部位。在細(xì)胞外使用抗Tat蛋白scFv可以明顯抑制Tat蛋白的內(nèi)化作用。細(xì)胞凋亡毒性試驗表明,抗Tat蛋白scFv可以有效地抑制Tat蛋白對Jurkat細(xì)胞的凋亡毒性作用。并且,該scFv蛋白對EC-304和HeLa細(xì)胞沒有毒性作用,說明scFv可能對細(xì)胞沒有毒性作用。 我們成功構(gòu)建了PET-32a-Tat重組質(zhì)粒,在大腸桿菌獲得了高效表達(dá),經(jīng)系列純化后,獲得了高純度的Tat融合蛋白。同時利用Tomlison(I+J)半合成噬菌體抗體庫成功篩選出一株特異性結(jié)合Tat蛋白的scFv,純化的scFv蛋白具有良好的生物學(xué)活性,為抗HIV-Tat scFv的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:浜虹被鍏嶇柅緙洪櫡鐥呮瘨(human immunodeficiency virus ,HIV)鏄幏寰楁，

本文編號：1436352