本文關鍵詞：結核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體的構建及表達　出處：《西南大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：結核病(Tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的慢性傳染病,MTB可能侵入人體全身各種器官,但主要侵犯肺,稱為肺結核。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,全世界每年有1000萬新發(fā)病例,150萬人死于結核病。我國高居全球結核病高負擔國家的第二位,現(xiàn)有MTB感染人數(shù)已達4億,傳染性TB患者達到200萬�？ń槊�(BCG)作為目前唯一用于預防結核病的疫苗,對于兒童重癥結核病如粟粒型結核和結核性腦膜炎具有預防作用,但是對于預防成年人結核病效果不理想,保護率為0-80%不等。目前,很多國家都在研究結核新疫苗,已有200多種的候選疫苗,其中有的正在進行動物模型實驗,有的已經進入臨床實驗。近幾十年,隨著耐藥MTB增多及HIV共感染等問題,加重了結核病的嚴重性。所以開發(fā)新型有效的結核病疫苗迫在眉睫,希望盡快開發(fā)出更安全、高效、低成本、并可廣泛用于各類人群的新型結核病疫苗。 本文以廣泛使用的Ad-Easy腺病毒包裝系統(tǒng)為基礎,構建結核分枝桿菌MPT83重組腺病毒疫苗。首先PCR獲取結核分枝桿菌MPT83基因,然后再將MPT83基因重組于穿梭載體pAdTrack-CMV;通過化學轉化法將線性化的重組穿梭質粒(pAdTrack-CMV-MPT83)和病毒骨架質粒(pAdEasy-1)共轉入大腸桿菌BJ5183,重組穿梭質粒和病毒骨架質粒在BJ5183發(fā)生同源重組形成重組腺病毒質粒(rAd-GFP-MPT83);線性化的重組腺病毒質粒轉染HEK293細胞,并于HEK293細胞中包裝成病毒;mRNA和蛋白水平上檢測目的基因的表達;大量擴增腺病毒,體外通過MTT實驗初步驗證重組腺病毒的免疫原性;體內通過重組腺病毒免疫小鼠,整體熒光成像觀察報告基因綠色熒光蛋白(GFP)在小鼠體內的表達與分布,間接跟蹤目的基因在小鼠體內的表達情況。結果表明: (1)成功構建結核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體,構建的重組腺病毒載體于HEK293細胞中成功包裝腺病毒。通過RT-PCR和Western-Blotting實驗,分別于mRNA和蛋白水平上檢測均表明結核分枝桿菌MPT83基因在HEK293細胞中表達。 (2)MTT實驗表明:vAd-GFP-MPT83病毒液比vAd-GFP病毒液具有更強的刺激體外淋巴細胞增殖的能力,證實了目的蛋白具有很強的刺激淋巴細胞增殖的能力,即其免疫原性。 (3)小鼠活體實驗表明:vAd-GFP-MPT83病毒免疫小鼠后,報告基因GFP于免疫后第4d達到高峰,一直到半個月之后還有很強的表達,同時表達的范圍也由原來注射的部位向周邊擴散。
[Abstract]:Tuberculosis tuberculosis (TB) is caused by Mycobacterium tuberculosis. MTB) the chronic infectious disease caused by MTB infection may invade various organs of the human body, but mainly invades the lungs, known as tuberculosis. According to the World Health Organization (WHO) statistics. There are 10 million new cases and 1.5 million deaths from tuberculosis in the world every year. China ranks second among the high-burden countries in the world, and the current number of MTB infection has reached 400 million. BCG, the only vaccine used to prevent tuberculosis, has a preventive effect on children with severe tuberculosis, such as miliary tuberculosis and tuberculous meningitis. At present, many countries are studying new TB vaccine, and there are more than 200 candidate vaccines. In recent decades, with the increase of drug-resistant MTB and HIV co-infection and other problems. Therefore, it is urgent to develop new and effective TB vaccine. We hope to develop a more safe, efficient, low-cost and widely used TB vaccine for all kinds of people as soon as possible. Based on the widely used Ad-Easy adenovirus packaging system, the recombinant adenovirus vaccine of Mycobacterium tuberculosis MPT83 was constructed. Firstly, the MPT83 gene of Mycobacterium tuberculosis was obtained by PCR. Then the MPT83 gene was recombined into the shuttle vector pAdTrack-CMV. The linearized recombinant shuttle plasmid pAdTrack-CMV-MPT83) and the viral skeleton plasmid pAdEasy-1) were co-transfected into Escherichia coli BJ5183 by chemical transformation. The recombinant shuttle plasmid and viral skeleton plasmid were homologous recombined in BJ5183 to form recombinant adenovirus plasmid rAd-GFP-MPT83; The linearized recombinant adenovirus plasmid was transfected into HEK293 cells and packaged into HEK293 cells. The expression of the target gene was detected at the level of mRNA and protein. A large number of adenovirus was amplified and the immunogenicity of recombinant adenovirus was preliminarily verified by MTT in vitro. Mice were immunized with recombinant adenovirus in vivo, and the expression and distribution of report gene GFP in mice were observed by whole fluorescence imaging. Indirect tracking of the expression of the target gene in mice. The results showed that: The recombinant adenovirus vector of Mycobacterium tuberculosis MPT83 was constructed successfully. The recombinant adenovirus vector was successfully packaged in HEK293 cells by RT-PCR and Western-Blotting experiments. Both mRNA and protein levels showed that the MPT83 gene of Mycobacterium tuberculosis was expressed in HEK293 cells. The results of MTT assay showed that the vAd-GFP virus solution had a stronger ability to stimulate lymphocyte proliferation in vitro than that of vAd-GFP virus solution. It is confirmed that the target protein has a strong ability to stimulate lymphocyte proliferation, that is, its immunogenicity. (3) in vivo mouse experiment showed that the reporter gene GFP reached its peak on the 4th day after inoculation with the virus, and was still strongly expressed half a month later. At the same time, the range of expression from the original injection site to the peripheral diffusion.
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346;Q789

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本文編號：1436445