本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)　出處：《西南大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核分枝桿菌 MPT83 重組腺病毒載體 重組腺病毒

【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的慢性傳染病,MTB可能侵入人體全身各種器官,但主要侵犯肺,稱為肺結(jié)核。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全世界每年有1000萬新發(fā)病例,150萬人死于結(jié)核病。我國高居全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家的第二位,現(xiàn)有MTB感染人數(shù)已達(dá)4億,傳染性TB患者達(dá)到200萬�？ń槊�(BCG)作為目前唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗,對于兒童重癥結(jié)核病如粟粒型結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎具有預(yù)防作用,但是對于預(yù)防成年人結(jié)核病效果不理想,保護(hù)率為0-80%不等。目前,很多國家都在研究結(jié)核新疫苗,已有200多種的候選疫苗,其中有的正在進(jìn)行動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn),有的已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。近幾十年,隨著耐藥MTB增多及HIV共感染等問題,加重了結(jié)核病的嚴(yán)重性。所以開發(fā)新型有效的結(jié)核病疫苗迫在眉睫,希望盡快開發(fā)出更安全、高效、低成本、并可廣泛用于各類人群的新型結(jié)核病疫苗。 本文以廣泛使用的Ad-Easy腺病毒包裝系統(tǒng)為基礎(chǔ),構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌MPT83重組腺病毒疫苗。首先PCR獲取結(jié)核分枝桿菌MPT83基因,然后再將MPT83基因重組于穿梭載體pAdTrack-CMV;通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將線性化的重組穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV-MPT83)和病毒骨架質(zhì)粒(pAdEasy-1)共轉(zhuǎn)入大腸桿菌BJ5183,重組穿梭質(zhì)粒和病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183發(fā)生同源重組形成重組腺病毒質(zhì)粒(rAd-GFP-MPT83);線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并于HEK293細(xì)胞中包裝成病毒;mRNA和蛋白水平上檢測目的基因的表達(dá);大量擴(kuò)增腺病毒,體外通過MTT實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證重組腺病毒的免疫原性;體內(nèi)通過重組腺病毒免疫小鼠,整體熒光成像觀察報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)在小鼠體內(nèi)的表達(dá)與分布,間接跟蹤目的基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果表明: (1)成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體,構(gòu)建的重組腺病毒載體于HEK293細(xì)胞中成功包裝腺病毒。通過RT-PCR和Western-Blotting實(shí)驗(yàn),分別于mRNA和蛋白水平上檢測均表明結(jié)核分枝桿菌MPT83基因在HEK293細(xì)胞中表達(dá)。 (2)MTT實(shí)驗(yàn)表明:vAd-GFP-MPT83病毒液比vAd-GFP病毒液具有更強(qiáng)的刺激體外淋巴細(xì)胞增殖的能力,證實(shí)了目的蛋白具有很強(qiáng)的刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力,即其免疫原性。 (3)小鼠活體實(shí)驗(yàn)表明:vAd-GFP-MPT83病毒免疫小鼠后,報(bào)告基因GFP于免疫后第4d達(dá)到高峰,一直到半個(gè)月之后還有很強(qiáng)的表達(dá),同時(shí)表達(dá)的范圍也由原來注射的部位向周邊擴(kuò)散。
[Abstract]:Tuberculosis tuberculosis (TB) is caused by Mycobacterium tuberculosis. MTB) the chronic infectious disease caused by MTB infection may invade various organs of the human body, but mainly invades the lungs, known as tuberculosis. According to the World Health Organization (WHO) statistics. There are 10 million new cases and 1.5 million deaths from tuberculosis in the world every year. China ranks second among the high-burden countries in the world, and the current number of MTB infection has reached 400 million. BCG, the only vaccine used to prevent tuberculosis, has a preventive effect on children with severe tuberculosis, such as miliary tuberculosis and tuberculous meningitis. At present, many countries are studying new TB vaccine, and there are more than 200 candidate vaccines. In recent decades, with the increase of drug-resistant MTB and HIV co-infection and other problems. Therefore, it is urgent to develop new and effective TB vaccine. We hope to develop a more safe, efficient, low-cost and widely used TB vaccine for all kinds of people as soon as possible. Based on the widely used Ad-Easy adenovirus packaging system, the recombinant adenovirus vaccine of Mycobacterium tuberculosis MPT83 was constructed. Firstly, the MPT83 gene of Mycobacterium tuberculosis was obtained by PCR. Then the MPT83 gene was recombined into the shuttle vector pAdTrack-CMV. The linearized recombinant shuttle plasmid pAdTrack-CMV-MPT83) and the viral skeleton plasmid pAdEasy-1) were co-transfected into Escherichia coli BJ5183 by chemical transformation. The recombinant shuttle plasmid and viral skeleton plasmid were homologous recombined in BJ5183 to form recombinant adenovirus plasmid rAd-GFP-MPT83; The linearized recombinant adenovirus plasmid was transfected into HEK293 cells and packaged into HEK293 cells. The expression of the target gene was detected at the level of mRNA and protein. A large number of adenovirus was amplified and the immunogenicity of recombinant adenovirus was preliminarily verified by MTT in vitro. Mice were immunized with recombinant adenovirus in vivo, and the expression and distribution of report gene GFP in mice were observed by whole fluorescence imaging. Indirect tracking of the expression of the target gene in mice. The results showed that: The recombinant adenovirus vector of Mycobacterium tuberculosis MPT83 was constructed successfully. The recombinant adenovirus vector was successfully packaged in HEK293 cells by RT-PCR and Western-Blotting experiments. Both mRNA and protein levels showed that the MPT83 gene of Mycobacterium tuberculosis was expressed in HEK293 cells. The results of MTT assay showed that the vAd-GFP virus solution had a stronger ability to stimulate lymphocyte proliferation in vitro than that of vAd-GFP virus solution. It is confirmed that the target protein has a strong ability to stimulate lymphocyte proliferation, that is, its immunogenicity. (3) in vivo mouse experiment showed that the reporter gene GFP reached its peak on the 4th day after inoculation with the virus, and was still strongly expressed half a month later. At the same time, the range of expression from the original injection site to the peripheral diffusion.
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R346;Q789

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 柴俊;羅家琴;蔣成硯;朱文豪;張以芳;;牛結(jié)核分枝桿菌Ag85b基因的克隆及表達(dá)[J];云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年S3期

2 王瑞博;井申榮;;結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白TB10.4的功能和應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2011年04期

3 牛雪;吳叢梅;高冷;趙韞慧;殷玉和;;結(jié)核分枝桿菌H_(37)Rv異檸檬酸裂解酶基因的克隆表達(dá)及活性[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2011年04期

4 康健;王麗梅;王平;趙勇;張薇;韓文東;丁悅娜;孫志平;柏銀蘭;徐志凱;;小鼠結(jié)核分枝桿菌耐藥模型的建立與評價(jià)[J];中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2011年04期

5 王華南;亓英芳;朱婷;于申業(yè);劉慧芳;司微;楊盛;王加明;馮擁軍;李素蘭;于秀婷;王春來;劉思國;;結(jié)核分枝桿菌pdhA基因的原核表達(dá)及其免疫原性分析[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2011年07期

6 向志光;林樹柱;董娜;袁偉;徐艷峰;秦川;;結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的脾臟和肺臟組織荷菌量與病理變化[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2011年08期

7 丁淑琴;王強(qiáng);王淑靜;王潔;張焱;;結(jié)核分枝桿菌rps12基因的克隆及核酸序列的分析[J];寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

8 胡錦;謝建平;;堿基切除修復(fù)與分枝桿菌基因組穩(wěn)定性[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

9 郭芳芳;鄒立林;吳英松;胡志明;李金龍;呂建新;高基民;;用于時(shí)間分辨熒光免疫分析的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白10參照品的制備[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年06期

10 石華;戈朝暉;賈偉;馬小明;牛寧奎;董輝;王自立;;結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白MPB64表達(dá)純化[J];寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 戴廣明;曹以誠;杜正平;陳洵;黃曙海;逄宇;周楊;黃海榮;趙雁林;;結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)快速檢測方法的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2010年

2 許優(yōu);孫惠平;張?jiān)鲑t;劉莉娜;;關(guān)于結(jié)核分枝桿菌定量方法的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 劉毅;李衛(wèi)民;田苗;孫照剛;李傳友;周輝;張治國;高鐵杰;高峰;;快速篩選定義北京基因型結(jié)核分枝桿菌的新方法[A];2007年中國防癆協(xié)會(huì)全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

4 張?jiān)滦?辛毅;馬郁芳;;結(jié)核分枝桿菌RmlB的表達(dá)、純化及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[A];2008年全國糖生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2008年

5 劉焰;劉勝武;談蓉;馬立新;劉君炎;;結(jié)核分枝桿菌Ag85B與ESAT-6雙順反子重組腺表達(dá)載體的構(gòu)建[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

6 吳園;鐘敏;王易偉;鐘靜;胡頻頻;毛旭虎;;Rv0341用于診斷依賴?yán)Ｆ浇Y(jié)核分枝桿菌結(jié)核病的研究概況[A];中國防癆協(xié)會(huì)臨床委員會(huì)、中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

7 張旭霞;張海青;李傳友;田苗;趙冰;李衛(wèi)民;張健源;印云青;焦揚(yáng);端木宏謹(jǐn);;結(jié)核分枝桿菌黏附素HBHA防治結(jié)核病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[A];2005年中國防癆協(xié)會(huì)全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

8 陳曦;張宗德;劉忠泉;賈紅彥;邢愛英;古書香;;結(jié)核分枝桿菌rv3873、rv3879c基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

9 周慶;方中飛;沈小英;宋冰;方孝美;;臨床分離結(jié)核分枝桿菌的耐藥性分析[A];2006年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

10 陳濤;周琳;周杰;江勇;周志剛;彭建明;文力;彭東東;何超文;鐘球;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測結(jié)核分枝桿菌的方法建立與臨床應(yīng)用評估[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2011年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 韓曉玲　通訊員 范敬群 金安江;華中農(nóng)大研究成果獲世界聲譽(yù)[N];湖北日報(bào);2009年

2 莊愉;新型抗結(jié)核疫苗的開發(fā)研究[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

3 記者 陳青;讓結(jié)核菌三天內(nèi)原形畢露[N];文匯報(bào);2009年

4 錢忠軍;華中農(nóng)大發(fā)現(xiàn)新基因有望控制結(jié)核病[N];江蘇科技報(bào);2009年

5 駐鄂記者 錢忠軍　通訊員 金安江 范敬群;發(fā)現(xiàn)可能控制結(jié)核病的新基因[N];文匯報(bào);2009年

6 記者 黃每裕;珠海推出兩種檢測試劑新產(chǎn)品[N];中國醫(yī)藥報(bào);2009年

7 莊愉;新型抗結(jié)核疫苗的開發(fā)研究[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

8 記者 項(xiàng)錚;團(tuán)山會(huì)議研討罕見病原體防治策略[N];科技日報(bào);2009年

9 ;整合力量 抗擊“瘟神”[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

10 宋心德;ＩＤＳＡ２基因?qū)е陆Y(jié)核桿菌產(chǎn)生抗藥性[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 董海燕;中國13省市結(jié)核分枝桿菌基因多態(tài)性分析[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2011年

2 陳嘉臻;結(jié)核分枝桿菌特異的RD2/RD11蛋白應(yīng)用于結(jié)核免疫診斷的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

3 王平;肺分枝桿菌感染臨床特征、耐藥模式、預(yù)后研究及肺組織結(jié)核分枝桿菌巢式PCR檢測[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

4 陳軍;武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性及氟喹諾酮耐藥分子機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2011年

5 陳軍;武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性及氟喹諾酮耐藥分子機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2011年

6 樂軍;耐藥結(jié)核分枝桿菌的多維分析[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

7 孫勇;北京地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥分子特點(diǎn)及結(jié)核分枝桿菌耐喹諾酮類藥物泵機(jī)制的初步研究[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2012年

8 劉凱;結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者和初發(fā)結(jié)核病患者免疫分子標(biāo)識的篩選[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

9 宋文剛;茜草素抗結(jié)核分枝桿菌作用機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2007年

10 姜曉穎;北京地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關(guān)系的研究[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳水木;結(jié)核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)[D];西南大學(xué);2008年

2 蔡溢;結(jié)核分枝桿菌RmlA的表達(dá)、純化以及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2006年

3 孫文霞;結(jié)核分枝桿菌抗原模擬肽納米金生物傳感器診斷結(jié)核病的研究[D];湖南師范大學(xué);2011年

4 王霞芳;IFN-γ增強(qiáng)BALB/c小鼠對結(jié)核分枝桿菌感染的抵抗力[D];蘇州大學(xué);2002年

5 曹立雪;應(yīng)用膜芯片檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

6 韓喜琴;噬菌體生物擴(kuò)增法檢測結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性研究及評價(jià)[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2004年

7 王琳;結(jié)核分枝桿菌ClpX和ClpP2蛋白酶的克隆表達(dá)及其性質(zhì)研究[D];西南大學(xué);2010年

8 丁衛(wèi)民;耐多藥肺結(jié)核與結(jié)核分枝桿菌L型感染的臨床研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2003年

9 吳玉敏;1.結(jié)核分枝桿菌去標(biāo)簽Mtb8.4-Hspx和Hspx-Mtb8.4基因克隆及表達(dá) 2.FTY720對腎移植受者治療的安全性和有效性系統(tǒng)評價(jià)[D];蘭州大學(xué);2010年

10 佘茜;結(jié)核分枝桿菌PPE68蛋白的表達(dá)及初步應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號：1436445