本文關鍵詞：熱休克蛋白70與p53相關載體構建及其在HepG2細胞系中共定位關系的研究　出處：《第四軍醫(yī)大學》2009年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 熱休克蛋白(heat shock protein HSPs)是細胞在不良環(huán)境因素作用下產生的一組重要的應激蛋白,它能保護機體(或細胞)不受或少受傷害。許多研究發(fā)現它在腫瘤,特別是惡性腫瘤中常有高表達。腫瘤細胞中的突變和異常蛋白質刺激hsp70的合成,使其呈現持續(xù)的高誘導表達,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。它能與癌基因、抑癌基因產物結合,具有抗腫瘤和細胞凋亡的作用。 腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與的多步驟的復雜過程,抑癌基因可能是抵御腫瘤發(fā)生的重要的保護機制。只要它們具有完整的活性,就可以有效抑制腫瘤的發(fā)生。P53是一個研究較早的抑癌基因,p53基因突變在約50%的惡性腫瘤中都存在。熱休克蛋白能與多種癌基因產物結合形成蛋白復合體,從而參與細胞轉化過程。已經有大量文獻報道在宮頸癌、乳腺癌、骨肉瘤組織中證實存在hsp70-p53復合物。熱休克蛋白70與突變p53之間有一定相關性,這可能是突變型p53(mp53)半衰期延長的原因之一。熱休克蛋白通過影響mtp53而參與腫瘤細胞的細胞周期調控及增殖,促進腫瘤細胞生長。我們實驗室近年的研究發(fā)現在人肝細胞肝癌(HCC)組織中有多種熱休克蛋白表達,其中部分hsp70與p53之間具有細胞核定位關系,并用免疫共沉淀方法證實了二者的相互結合。 本實驗在前期實驗的基礎上利用定點突變合成p53基因突變子,并構建綠色熒光蛋白表達載體,進而觀察其在HepG2細胞中與內源性熱休克蛋白70的共定位關系。結果發(fā)現HepG2細胞中有內源性hsp70的高表達,并且定位于細胞質中。含有p53的熒光蛋白表達載體轉入HepG2內可觀察到野生型p53、249位點突變的p53均定位于細胞核,273位點突變的p53與hsp70共定位于細胞質。p53的不同定位可能與其定點突變后改變蛋白構型遮蓋其C末端核定位信號(nuclear localization signal NLS)有關。Hsp70作為分子伴侶與點突變的p53存在相互作用,通過p53不同的細胞內定位引起部分hsp70相伴定位于細胞核。Hsp70與不同的點突變p53基因有不同的定位,且與273位點突變的p53主要共定位于細胞質,這一結果與我們發(fā)現的肝癌組織中的兩者主要定位于細胞核相矛盾,這些均提示hsp70與p53在細胞核的定位與兩者的相互作用關系存在某種機制。為進一步研究熱休克蛋白70對肝癌細胞系HepG2生物學行為的影響以及其與p53的關系,我們利用腺病毒包裝系統(tǒng)以及慢病毒干涉載體系統(tǒng),分別構建了含有熱休克蛋白70基因的重組腺病毒載體以及針對熱休克蛋白70的慢病毒干涉載體,成功包裝出含有熱休克蛋白70基因的腺病毒顆粒并感染HepG2細胞,腺病毒的成功包裝及慢病毒載體的成功構建為以后的實驗奠定了一個良好的研究基礎。
[Abstract]:Heat shock protein (shock protein HSPs) is an important group of stress proteins produced by cells under adverse environmental factors. It can protect the body (or cell) from injury or injury. Many studies have found that it is often overexpressed in tumor, especially in malignant tumor. Mutation and abnormal protein in tumor cells stimulate the synthesis of hsp70. It can combine with oncogene and tumor suppressor gene product and has the function of anti-tumor and apoptosis. Tumorigenesis and development is a complex process involving multiple genes. Tumor suppressor genes may be an important protective mechanism against tumorigenesis as long as they have complete activity. P53 is an earlier tumor suppressor gene. P53 gene mutations are present in about 50% malignant tumors. Heat shock proteins (HSPs) can bind to multiple oncogene products to form protein complexes. Thus participate in the process of cell transformation. There have been a lot of literature in cervical cancer, breast cancer. Hsp70-p53 complex was found in osteosarcoma tissues. There was a correlation between heat shock protein 70 (HSP70) and mutant p53. This may be one of the reasons for the prolonged half-life of mutant p53mp53. Heat shock proteins (HSPs) are involved in the regulation of cell cycle and proliferation of tumor cells by affecting mtp53. Our laboratory research in recent years has found that there are a variety of heat shock proteins expressed in human hepatocellular carcinoma (HCC) tissues. Some of them had nuclear localization relationship between hsp70 and p53, and their binding was confirmed by immunoprecipitation. On the basis of previous experiments, p53 gene mutants were synthesized by site-directed mutagenesis and green fluorescent protein expression vector was constructed. The co-localization of endogenous heat shock protein 70 (HSP70) in HepG2 cells was observed. The results showed that there was a high expression of endogenous hsp70 in HepG2 cells. The fluorescent protein expression vector containing p53 was transferred into HepG2 and the mutation of wild type p53n249 was observed in the nucleus. The different localization of p53 and hsp70 co-located in cytoplasm. P53 may be related to the alteration of protein configuration after site-directed mutation to cover its C-terminal nuclear localization signal (P < 0.05). Nuclear localization signal NLS). Hsp70 as a molecular chaperone interacts with point mutant p53. By different intracellular localization of p53, some hsp70 concomitant loci were located in the nucleus. Hsp70 had different localization with different point mutation p53 gene. P53 with 273 mutation is mainly located in the cytoplasm, which is inconsistent with the nuclear localization in the liver cancer tissues we found. These results suggest that there is a mechanism between the nuclear localization of hsp70 and p53 and their interaction. To further study the effect of heat shock protein 70 on the biological behavior of hepatocellular carcinoma cell line HepG2. And its relationship with p53. We constructed recombinant adenovirus vector containing heat shock protein 70 gene and lentivirus interference vector targeting heat shock protein 70 using adenovirus packaging system and lentivirus interference vector system respectively. Adenovirus particles containing heat shock protein 70 gene were successfully packaged and infected with HepG2 cells. The successful packaging of adenovirus and the successful construction of lentivirus vector laid a good foundation for future experiments.
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346

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本文編號：1433254