本文關(guān)鍵詞：1、GEP蛋白在骨骼肌分化過程中的功能研究 2、ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究　出處：《山東大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： GEP MyoD 骨骼肌 分化 JunB ADAMTS-12 分化 軟骨 金屬蛋白酶 PTHrP通路

【摘要】： GEP(granulin-epithelin precursor)蛋白是一種自分泌生長因子,也被稱為progranulin,proepithelin,acrogranin或者PC細(xì)胞衍生生長因子,是一個(gè)68.5-kDa大小的分泌性生長因子。它的序列高度保守,幾乎在所有真核生物中均表達(dá)。該蛋白高度糖基化,在SDS-PAGE上呈現(xiàn)為分子量大小約90-kDa。結(jié)構(gòu)上,它屬于生長因子家族。GEP可以以完整蛋白形式分泌,或者被蛋白水解,以多肽的形式分泌,即組成GEP蛋白的多肽片段一顆粒體蛋白(granulin)。GEP蛋白作為一種具有較大分子量的自分泌生長因子,參與多種生理性和病理性過程。GEP蛋白在代謝較快的上皮細(xì)胞,免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中豐富表達(dá)。同時(shí),在人類幾種癌組織中也有報(bào)道GEP蛋白高度表達(dá),有理由相信,GEP蛋白會(huì)導(dǎo)致乳腺癌,透明細(xì)胞腎癌,侵襲性卵巢癌,成膠質(zhì)細(xì)胞瘤,脂肪畸胎瘤,多發(fā)性骨髓瘤和骨肉瘤。同時(shí),越來越多的證據(jù)表明GEP蛋白也參與分化、發(fā)育和病理過程中的調(diào)節(jié)。 本文主要研究GEP蛋白在骨骼肌分化中的作用和機(jī)制。骨骼肌分化過程是受一些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的(成肌因子家族),包括MyoD,Myf5,myogenin和MRF4。成肌因子在肌分化過程中起著重要的作用,如果在任何非成肌細(xì)胞(例如10T1/2成纖維細(xì)胞)中異位表達(dá)這些成肌因子,將會(huì)導(dǎo)致多種肌分化基因的表達(dá),促使其向肌管分化。本研究以GEP蛋白為主要研究對象,系統(tǒng)的探討了GEP蛋白在成肌細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制,首次揭示了GEP蛋白在成肌細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用及其相應(yīng)的分子機(jī)制: 1.我們利用免疫組織化學(xué)染色的方法,顯示GEP蛋白在胚胎肌肉組織中表達(dá),應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,證明GEP在C2C12細(xì)胞向肌管分化過程中,GEP表達(dá)量是增高的,無論是mRNA水平還是蛋白水平。提示GEP在調(diào)節(jié)骨骼肌分化中起作用。 2.應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,證明MyoD可以誘導(dǎo)內(nèi)源性GEP的表達(dá),無論在轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平都增加。 3.通過對GEP基因核酸序列的分析,發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)有5個(gè)潛在的MyoD結(jié)合位點(diǎn),我們使用了4個(gè)GEP特異性報(bào)告基因質(zhì)粒,含有不同數(shù)量的MyoD結(jié)合位點(diǎn),共轉(zhuǎn)染上述報(bào)告基因與MyoD的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過檢測熒光素酶表達(dá)活性研究MyoD對于GEP表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,MyoD可以激活GEP特異報(bào)告基因,MyoD在成肌細(xì)胞分化過程中具有調(diào)節(jié)GEP轉(zhuǎn)錄的功能。 4.應(yīng)用點(diǎn)突變技術(shù),我們在報(bào)告基因271GEP-luc中GEP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)引入了MyoD結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MyoD失去激活作用,同時(shí)應(yīng)用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)及染色質(zhì)免疫共沉淀,證明在成肌細(xì)胞分化過程中MyoD對GEP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用通過MyoD直接結(jié)合到GEP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的MyoD結(jié)合位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)。 5.我們研究了GEP過表達(dá)與低水平對成骨細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示,在成肌細(xì)胞分化過程中,高水平GEP能夠抑制成肌細(xì)胞的分化,而在低GEP的細(xì)胞環(huán)境中,分化被促進(jìn)了。 6.為了揭示GEP抑制骨骼肌分化的分子機(jī)制,我們進(jìn)一步研究了GEP在肌分化過程中,對成肌因子家族的作用。實(shí)驗(yàn)證明GEP在成肌細(xì)胞分化過程中抑制MyoD、Myf5、Myogenin、MHC基因的表達(dá)。 7.JunB可以抑制骨骼肌分化。我們在肌分化的早期,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光檢測GEP對JunB表達(dá)的調(diào)控,發(fā)現(xiàn)GEP誘導(dǎo)JunB的表達(dá)。成功構(gòu)建JunB表達(dá)質(zhì)粒及JunB siRNA質(zhì)粒,通過檢測熒光素酶表達(dá)活性及MHC的表達(dá)證明GEP抑制成肌細(xì)胞分化的作用部分依賴于JunB。 本研究針對骨骼肌發(fā)生中的分子調(diào)節(jié),首次闡述了GEP蛋白抑制骨骼肌分化的作用和分子機(jī)制,進(jìn)一步揭示骨骼肌生長與修復(fù)的機(jī)理,為提出更多的治療肌肉疾病、肌肉創(chuàng)傷修復(fù)的方法奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。 金屬蛋白酶ADAMTS-12屬于ADAMTS家族(含TSP結(jié)構(gòu)的去整合素金屬蛋白酶，a disintcgrin and metalloproteas~with thromospondin motifs，ADAMTS)，其對降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和關(guān)節(jié)炎具有非常重要的作用。ADAMTS家族含有分泌性鋅指蛋白，并且有較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆肿咏Y(jié)構(gòu)，至少包括一個(gè)thrombospondinmotifs重復(fù)結(jié)構(gòu)。這個(gè)家族具有重要的功能，ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-8、ADAMTS-9、ADAMTS-1 6和ADAMTS-1 8可以降解多聚蛋白糖，ADAMTS-5在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中蛋白多聚糖的丟失上起著重要的作用。ADAMTS-2、ADAMTS-3和ADAMTS-14膠原前肽。ADAMTS-2突變會(huì)導(dǎo)致皮膚脆裂癥，一種嚴(yán)重的皮膚遺傳病。ADAMTS-13是VW因子清除蛋白酶，，它的突變會(huì)導(dǎo)致遺傳性的致命疾病，血小板減少性紫癜。ADAMTS-7和ADAMTS-12具有相同的結(jié)構(gòu)域組成，構(gòu)成ADAMTS家族的亞型。我們最初報(bào)道ADAMTS-7和ADAMTS-12直接結(jié)合降解軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilageoligomcric matrix protein，COMP))，一種軟骨最主要的非膠原組成物。COMP是由五個(gè)l 10-kDa的多結(jié)構(gòu)域糖蛋白亞基，通過二硫鍵構(gòu)成一個(gè)524-kDa的復(fù)合體。COMP基因突變和常染色體顯性肢斷短小癥…-假性軟骨發(fā)育不全和多發(fā)性骨骺發(fā)育不良…-的發(fā)生有關(guān)。在膝關(guān)節(jié)損傷、創(chuàng)傷、原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的患者軟骨、關(guān)節(jié)滑液和血清中，都可以檢測到COMP的片段。我們知道只要能夠抑制降解軟骨的蛋白酶類就可以滯后或阻止疾病的進(jìn)展，因此有人從病理生理學(xué)或治療學(xué)的觀點(diǎn)上提出隔離蛋白酶或使用抑制劑來抑制病情的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，純化的COMP蛋白在體外可以被幾種基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)所降解，包括間質(zhì)膠原酶-1(interstitial collagenase-1，MMP-1)、膠原蛋白酶-3(collagenase-3，MMP-13)、基質(zhì)溶解素-1(stromelysin-1，MMP-3)、明膠酶B(gelatinase-B，MMP-9)、MMP·19和釉質(zhì)溶解素(enamelysin，MMP-20)。另外，ADAMTS家族中的ADAMTS-4被發(fā)現(xiàn)也具有體外酶切COMP的功能。然而我們體外酶切試驗(yàn)中所應(yīng)用的蛋白酶和底物的濃度，都比人體生理、病理?xiàng)l件下的濃度要高。雖然體內(nèi)COMP的量和ADAMTS的水平之間沒有相關(guān)的數(shù)據(jù)支持他們的關(guān)聯(lián)性，但是很有可能COMP的降解正是由這些金屬蛋白酶調(diào)節(jié)的，至少部分受他們調(diào)節(jié)。另外，我們研究發(fā)現(xiàn)a-2-巨球蛋白可以抑制COMP蛋白的降解。最近還有研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-12也能夠降解軟骨聚集蛋白多糖。 研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨分化過程中ADAMTS-12的表達(dá)量顯著增高，意味著在骨骼發(fā)育中ADAMTS-12的表達(dá)量在時(shí)間、空間上都有變化。ADAMTS-12蛋白不但在體外軟骨分化中被誘導(dǎo)表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的生長板軟骨細(xì)胞中同樣可以發(fā)現(xiàn)ADAMTS-12的表達(dá)增高。ADAMTS-12能夠抑制軟骨細(xì)胞的分化及軟骨成骨，此抑制分化的功能是依賴于ADAMTS-12的蛋白酶活性的。ADAMTS-12的cysteine-fich結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-12與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和細(xì)胞膜表面定位是必不可少的，C一末端的4個(gè)TSP結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-12的蛋白水解酶活性和抑制軟骨細(xì)胞分化功能也是必需的。因此，ADAMTS-12對于軟骨細(xì)胞分化和軟骨成骨起負(fù)調(diào)控功能，這種抑制功能嚴(yán)格地依賴于ADAMTS-12的酶切活性。而當(dāng)ADAMTS-12發(fā)生點(diǎn)突變后，則完全喪失了酶切活性-同時(shí)也喪失了對軟骨細(xì)胞的抑制作用。 ADAMTS-12由多個(gè)功能性亞基構(gòu)成，包括：ADAMTS-12包括一個(gè)鋅離子催化結(jié)構(gòu)域和其他幾個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域，包括：1個(gè)disintegrin結(jié)構(gòu)域、1個(gè)thrombospondin結(jié)構(gòu)域、1個(gè)cystdne-dch結(jié)構(gòu)域(CRD)、1個(gè)spaccr-I結(jié)構(gòu)域、3個(gè)thrombospondin motifs、1個(gè)space~-2結(jié)構(gòu)域和C-末端4個(gè)thrombospondinmotifs。研究發(fā)現(xiàn)C-末端的4個(gè)thrombospondin motifs具有結(jié)合底物的功能，如結(jié)合COMP，而ADAMTS-12的其他功能結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能卻還都不清楚。為了揭示各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能，我們構(gòu)建了一系列的ADAMTS-12的C-末端缺失突變體，發(fā)現(xiàn)ADAMTS-12的cysteine-rich結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏DAMTS-12與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和細(xì)胞膜表面定位是必不可少的。ADAMTS-12的酶切活性受到非催化亞基的調(diào)控，尤其是C-末端的4個(gè)thrombospondin motifs和抑制性spacer-2結(jié)構(gòu)域。另外，ADAMTS-12的抑制軟骨分化功能同樣也受到非催化亞基的調(diào)控，尤其是C-末端的4個(gè)thrombospondin motifs重復(fù)結(jié)構(gòu)。 本文研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-12作為軟骨分化的重要負(fù)調(diào)控因子，影響軟骨細(xì)胞分化和軟骨內(nèi)成骨。這種抑制軟骨分化的功能嚴(yán)格地依賴于ADAMTS-12的酶切活性，而當(dāng)ADAMTS-12發(fā)生點(diǎn)突變后，則完全喪失了酶切活性，同時(shí)也喪失了對軟骨細(xì)胞的抑制作用。ADAMTS—12的酶切活性受到非催化亞基的調(diào)控，尤其是C。末端的4個(gè)thrombospondin motifs和抑制性spac~-2結(jié)構(gòu)域。另外，ADAMTS-12的抑制軟骨分化功能同樣也受到非催化亞基的調(diào)控，尤其是C-術(shù)端的4個(gè)thrombospondin motifs重復(fù)結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:GEP is a self - secreted growth factor , also known as progranulin , proepistle , acrogranin , or PC cell - derived growth factor , a 68.5 - kDa secreted growth factor . Its sequence is highly conserved and is expressed in almost all eukaryotic organisms . In this paper , the roles and mechanisms of GEP protein in skeletal muscle differentiation are studied . The skeletal muscle differentiation process is regulated by some transcription factors ( myogenic factor family ) , including myoD , Myf , myogenin and MRF4 . The myogenic factor plays an important role in myogenesis . 1 . The expression of GEP protein in fetal muscle tissue was demonstrated by immunohistochemical staining . The expression of GEP was increased in C2C12 cells during the differentiation of C2C12 cells to myotubes , both mRNA and protein levels . 2 . Using immunofluorescence and real - time fluorescence quantitative PCR method , we prove that MyoD can induce the expression of endogenous GEP , both at transcription level and protein level . 3 . Through the analysis of the nucleic acid sequence of GEP gene , five potential myoD binding sites were found in the transcriptional regulatory region . Four GEP - specific reporter plasmids were used to co - transfected the reporter gene and the eukaryotic expression plasmid of MyoD . The results showed that MyoD could activate the GEP - specific reporter gene and MyoD had the function of regulating the transcription of GEP during the differentiation of myoblasts . 4 . Using point mutation technique , we introduced the point mutation of MyoD binding site in the transcriptional regulatory region of GEP in 271GEP - luc reporter gene . 5 . We studied the effects of overexpression and low level of GEP on osteoblast differentiation . The results showed that high levels of GEP inhibited the differentiation of myoblasts during the differentiation of myoblasts , whereas in low GEP cells , differentiation was promoted . 6 . In order to reveal the molecular mechanism of GEP in inhibiting skeletal muscle differentiation , we further studied the role of GEP in myogenic differentiation . 7 . JunB can inhibit the differentiation of skeletal muscle . In the early stage of muscle differentiation , we used real - time fluorescent quantitative PCR , Western blot and cellular immunofluorescence to detect the expression of JunB . We found that GEP induced the expression of JunB . The JunB expression plasmid and JunB siRNA plasmid were successfully constructed . According to the molecular regulation of skeletal muscle , the mechanism of inhibition of skeletal muscle differentiation by GEP protein was first introduced , and the mechanism of skeletal muscle growth and repair was further revealed . It is an important role in the degradation of extracellular matrix proteins and arthritis in mouse arthritis models . It is found that the purified COMP protein can be degraded by several matrix metalloproteinases , matrix metalloproteinases - 1 , MMP - 1 , MMP - 3 , MMP - 13 , stromelysin - 1 , MMP - 3 , gelatinase B ( MMP - 9 ) , MMP - 19 , and enamel cytolysin ( MMP - 20 ) . in addition , that concentration of the protease and substrate used in the in vitro enzyme digestion assay was found to have the function of in vitro enzyme cleavage COMP . however , the concentration of the protease and substrate used in our in vitro enzyme digestion assay was higher than the concentration of the human physiological and pathological condition . It is found that the expression level of TS - 12 is significantly increased in the course of cartilage differentiation , which means that the expression level of TS - 12 can be increased in time and space . In order to reveal the function of various domains , we have constructed a series of C - terminal deletion mutants . In this study , it has been found that an important negative regulatory factor , which is the differentiation of cartilage , plays an important role in the differentiation of cartilage cells and the formation of bone in cartilage . The function of inhibiting the differentiation of cartilage is dependent on the enzyme - cutting activity and the inhibitory effect on chondrocytes . The enzyme - cutting activity of the TS - 12 is regulated by the non - catalytic subunit , especially the 4 spondin and inhibitory spac ~ - 2 domains of C .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1433149