本文關鍵詞：免疫增效型廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗的基礎研究　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 背景與目的： 上世紀70年代由Judah Folkman提出的有關腫瘤血管生成的理論已被廣泛接受,目前,抗腫瘤血管生成已經(jīng)成為腫瘤學基礎研究及臨床治療領域中最有前景的策略之一。大量研究證據(jù)表明,在眾多的血管生成刺激因子中,內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體VEGFR2(鼠中稱為flk-1,人中稱為KDR)對于與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移密切相關的血管生成是最重要的,許多旨在通過打破VEGF/VEGFR2傳導通路抑制腫瘤血管生成的主動免疫實驗研究都取得了比較理想的結果,還有研究表明,與全長基因疫苗相比,編碼VEGFR2胞外1-4區(qū)的基因疫苗同樣能夠有效降低小鼠血清中VEGF水平,從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。 構建一種能夠誘導有效免疫反應基因疫苗的關鍵是打破對靶抗原的自身免疫耐受,在這項研究中我們主要采取三項措施解決這一問題。首先,選取異種同源的小鼠VEGFR2胞外1-4 IgG樣區(qū)域(簡稱mVEGFR2(1-4))作為疫苗的靶抗原；其次,將人白細胞介素12(hIL-12)融合基因插入到載體IRES序列的下游,構建一個下游可以同時表達hIL-12雙亞基的雙順反子真核表達載體pVAX1-IRES-hIL12,hIL-12作為對體內(nèi)細胞和體液免疫系統(tǒng)作用最強的免疫活性因子及一種抗血管生成因子,在基因疫苗中以免疫佐劑的形式發(fā)揮作用；最后,為了增強本疫苗的免疫粘附及抗原遞呈功能,本研究利用真核表達載體pCI-Fc-GPI,實現(xiàn)了人Igk前導信號肽、人IgG-Fc段及GPI與靶抗原mVEGFR2(1-4)的共同表達,成功構建了免疫增效型廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗pVAX1-sig-mVEGFR2(1-4)-Fc-GPI-IRES-hIL 12(簡稱pVAX1-mVEGFR2-hIL12)。 方法： 通過搭橋PCR獲得人白細胞介素12 P35及P40雙亞基的融合基因P35-F2A-P40,插入已構建好的DNA疫苗載體pVAX1-IRES下游,構建質(zhì)粒載體pVAX1-IRES-hIL12;通過RT-PCR的方法從Balb/c小鼠胚胎組織中特異性擴增mVEGFR2(1-4)基因,連接到真核表達載體pVAX1-IRES-hIL12的上游,構建基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞,用ELISA、免疫熒光和流式細胞術分別檢測293T細胞中hIL-12和mVEGFR2(1-4)基因的蛋白表達。 結果： 特異性擴增得到大小與mVEGFR2(1-4)基因相符的基因片段,序列測定證實與GenBank(GI:57923)上登錄的序列一致；酶切鑒定和序列分析表明P35及P40雙亞基融合基因P35-F2A-P40與設計完全一致,融合基因在體外細胞培養(yǎng)液檢測中獲得分泌表達；成功構建了廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。FACS及IMF檢測證實重組基因疫苗得到有效表達。 結論： 成功構建了免疫增效型廣譜抗腫瘤血管基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12,為后續(xù)研究中進一步評價該疫苗抗腫瘤血管生成的效果奠定了必要基礎,并為腫瘤免疫治療領域提供了一種新的疫苗研究方向。
[Abstract]:Background and purpose: In -30s, the theory of tumor angiogenesis proposed by Judah Folkman has been widely accepted. Anti-angiogenesis has become one of the most promising strategies in the basic research and clinical treatment of oncology. Endothelial growth factor (VEGF) and its receptor VEGFR2 (called flk-1 in mice and KDRs in humans) are the most important for angiogenesis closely related to tumor growth and metastasis. Many active immunological studies aimed at inhibiting tumor angiogenesis by breaking the VEGF/VEGFR2 conduction pathway have achieved satisfactory results, and studies have shown that compared with full-length gene vaccines. The gene vaccine encoding the extracellular 1-4 region of VEGFR2 can also effectively reduce the level of VEGF in the serum of mice, thus inhibiting the growth and metastasis of tumor. The key to construct a gene vaccine that can induce an effective immune response is to break the autoimmune tolerance to target antigen. In this study, we mainly take three measures to solve this problem. The heterologous mouse VEGFR2 extracellular 1-4 IgG like region (mVEGFR2P1-4) was selected as the target antigen of the vaccine. Secondly, the fusion gene of human interleukin-12hIL-12 was inserted into the downstream of the vector IRES sequence. To construct a downstream eukaryotic expression vector pVAX1-IRES-hIL12 which can simultaneously express hIL-12 double subunits. HIL-12, as the most potent immunoreactive factor and an anti-angiogenic factor, plays an important role in gene vaccine as an immune adjuvant. Finally, in order to enhance the immune adherence and antigen presentation of the vaccine, the eukaryotic expression vector pCI-Fc-GPI was used to realize human Igk precursor signal peptide. The co-expression of human IgG-Fc fragment and GPI with target antigen mVEGFR2O1-4. The immune-synergistic broad-spectrum anti-angiogenesis gene vaccine pVAX1-sig-mVEGFR2(1-4)-Fc-GPI-IRES-hIL _ (12) was successfully constructed. For short, pVAX1-mVEGFR2-hIL12. Methods: The fusion gene P35-F2A-P40 of human interleukin 12 P35 and P40 double subunits was obtained by bypass PCR. The plasmid vector pVAX1-IRES-hIL12 was constructed by inserting the constructed DNA vaccine vector pVAX1-IRES downstream. The mVEGFR2O1-4) gene was specifically amplified from the embryonic tissues of Balb/c mice by RT-PCR. The gene vaccine pVAX1-mVEGFR2-hIL12was constructed by ligation to the upstream of eukaryotic expression vector pVAX1-IRES-hIL12. Liposome method was used to transfect 293T cells. The protein expression of hIL-12 and mVEGFR2O1-4 in 293T cells were detected by Elisa, immunofluorescence and flow cytometry, respectively. Results: The specific amplification showed that the size of the gene was consistent with that of the mVEGFR2O1-4) gene, which was confirmed by sequence determination to be the same as the sequence entered on GenBank Gi: 57923. Restriction endonuclease analysis and sequence analysis showed that P35 and P40 double subunit fusion genes P35-F2A-P40 were completely consistent with the design. The fusion gene was secreted and expressed in vitro cell culture medium. PVAX1-mVEGFR2-hIL12.FACS and IMF analysis showed that the recombinant gene vaccine was effectively expressed. Conclusion: The immune-synergistic broad-spectrum anti-angiogenic gene vaccine pVAX1-mVEGFR2-hIL12 was successfully constructed. It lays a necessary foundation for further evaluation of the anti-angiogenesis effect of the vaccine and provides a new vaccine research direction for tumor immunotherapy.
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392.1

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本文編號：1433269