本文關(guān)鍵詞：人類肝臟JAK-STAT相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： JAK-STAT是重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡等重要過程。JAK-STAT信號通路的許多成員在成人肝臟中表達(dá),并參與肝再生、免疫等過程,不正常的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可致肝癌和代謝綜合癥,提示JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝臟中有重要的作用。 雖然信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究是最熱門的研究方向之一,也取得了重大成果,但相對于復(fù)雜生命現(xiàn)象來說,現(xiàn)在對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的了解還是非常有限,許多重要問題仍需要更多的研究去回答和完善,如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最基礎(chǔ)的問題  每個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路究竟包含哪些成分?不同細(xì)胞不同組織器官的不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包含哪些成分?因此,系統(tǒng)構(gòu)建正常成人肝的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互作用網(wǎng)絡(luò),將有利于了解成人肝JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其復(fù)雜性,有助于研究其特異調(diào)控規(guī)律和發(fā)現(xiàn)它調(diào)控成人肝功能的分子機(jī)制,并為了解肝臟特殊生理功能及肝臟病理和疾病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)相互作用是細(xì)胞發(fā)揮功能的基礎(chǔ),規(guī)�；瘶�(gòu)建和分析蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖有助于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)功能、新的調(diào)控途徑以及不同調(diào)控途徑間內(nèi)在聯(lián)系、揭示細(xì)胞分子的作用機(jī)制。酵母雙雜交方法是大規(guī)模構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖的重要方法,已成功用于規(guī)模構(gòu)建酵母、線蟲、果蠅、人的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。所以,本文以肝臟中表達(dá)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白為誘餌,采用酵母雙雜交技術(shù)篩選成人肝臟cDNA文庫,從蛋白質(zhì)相互作用角度出發(fā),對肝臟JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究。 我們選取了42個基因,設(shè)計構(gòu)建含不同結(jié)構(gòu)域片段或全長的誘餌106個,成功構(gòu)建了41個基因的98個誘餌,除去20個有自激活活性的誘餌無法篩庫外,對31個基因的78個誘餌進(jìn)行了肝臟cDNA文庫篩選。經(jīng)過報告基因表型鑒定,得到3,000多個初始陽性克隆,通過采取時序分批測序策略,送測序總克隆數(shù)大約1,480個,最后測序成功克隆數(shù)為1,384個。測序序列比對后共有24個誘餌沒有獲得相互作用獵物,22個基因的54個誘餌篩到了1-63個相互作用獵物,最后我們的22個基因通過篩庫得到了同262個獵物的相互作用345對,平均15.6對/基因(345/22),同人類遺傳共濟(jì)失調(diào)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)報道的結(jié)果18.3對/基因(770/42)接近,再次證實(shí)了通過構(gòu)建一個基因的多個片段及全長誘餌進(jìn)行篩庫可得到較多的相互作用,一定程度彌補(bǔ)了嚴(yán)謹(jǐn)型酵母雙雜交系統(tǒng)假陰性的缺陷。另外,通過對比已知相互作用對在篩庫所得相互作用對的比例及分析不同表型相互作用對平均對應(yīng)克隆數(shù)的結(jié)果,證實(shí)了我們采用的Y2H系統(tǒng)是有效的。 為了降低假陽性,我們采用嚴(yán)謹(jǐn)型酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行篩庫。但任何技術(shù)的大規(guī)模實(shí)驗結(jié)果都不可能避免假陽性結(jié)果。為了評價數(shù)據(jù)的可信度,我們分別對技術(shù)假陽性和生物學(xué)假陽性進(jìn)行了評價。對于技術(shù)假陽性我們采用酵母回轉(zhuǎn)驗證的方法進(jìn)行評估。我們對提取得到獵物質(zhì)粒的304對相互作用進(jìn)行酵母回轉(zhuǎn)驗證,通過表型鑒定,共162對相互作用再現(xiàn)陽性表型,回轉(zhuǎn)陽性率為53.3%。通過表型分類分析回轉(zhuǎn)陽性率發(fā)現(xiàn):已知相互作用的回轉(zhuǎn)陽性率只有66.6%。這些表明:Y2H存在技術(shù)假陽性,同時假陰性也是本研究所使用Y2H系統(tǒng)一個突出問題,這提示我們需慎重對待回轉(zhuǎn)呈陰性的相互作用,不能輕易的去除它們。因此,還需要借助其他實(shí)驗方法,如免疫共沉淀、GST pull-down等來對技術(shù)假陽性的作評價,目前我們正在建立基于免疫共沉淀原理的芯片Co-IP技術(shù),以便規(guī)�；仳炞C。 在生物學(xué)假陽性評價方面,我們采用了多種生物信息學(xué)分析方法,即通過整合基因表達(dá)水平、基因敲除表型、GO功能注釋、相互作用結(jié)構(gòu)域、模式生物同源性比較等12項相關(guān)研究數(shù)據(jù),以盡可能量化、全面、系統(tǒng)的評價。結(jié)果有32.5%(112/345)相互作用對存在相互作用結(jié)構(gòu)域,1.7%(6/345)相互作用對其模式生物同源蛋白為已知相互作用,46.4%(160/345)相互作用對的獵物與誘餌共享GO共定位三級或以上注釋,35.9%(124/345)相互作用對的獵物與誘餌共享GO生物學(xué)/功能三級或以上注釋,11%(38/345)的相互作用對的獵物與誘餌基因表達(dá)水平相關(guān),32.4%(112/345)相互作用在已報道網(wǎng)絡(luò)中把其它相互作用連接成三環(huán)(three-protein-interaction loop),56.8%(196/345)相互作用在已報道網(wǎng)絡(luò)中把其它相互作用連接成四環(huán)(four-protein-interaction loop),2%(7/345)相互作用對的獵物與誘餌共通路,1.5%(5/345)相互作用對的獵物在模式生物中被鑒定為JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能相關(guān)成分(RNAi),29.3%(101/345)相互作用對的獵物與誘餌在鼠基因敲除中表現(xiàn)出相似或相同的表型,2%(7/345)相互作用對的獵物與誘餌參與同類疾病。這些證據(jù)都不同程度地支持我們篩到的相互作用是可信的。 為了直觀判斷每對相互作用的可信度和獲得整體數(shù)據(jù)的可信度信息,我們整合了實(shí)驗數(shù)據(jù)和各項生物信息分析數(shù)據(jù),建立了一個包含4種實(shí)驗數(shù)據(jù)和12個生物信息學(xué)分析結(jié)果共16項指標(biāo)的可信度評分體系。使用該體系對每對相互作用進(jìn)行可信度打分,根據(jù)得分情況將所有相互作用分為低、中、高可信度相互作用:分值在0.35-2.5的相互作用被認(rèn)為是低可信度的相互作用,占所有相互作用的50.7%(175/345);分值為2-5的相互作用被認(rèn)為是中可信度相互作用,占所有相互作用的36.5%(126/345);分值大于5的相互作用被認(rèn)為是高可信度相互作用,占所有相互作用的12.8%(44/345),后兩項總共占49.3%,說明我們的相互作用約一半是具有較高可信度的相互作用。通過分等級發(fā)現(xiàn),高可信度的相互作用既有前7項的物理互作證據(jù)支持,也有后面的功能相關(guān)證據(jù)支持。另外,通過對已知相互作用的分析,顯示我們的評分體系可能比PRINCESS的評分體系更穩(wěn)定和有效。 最后,我們對所獲得的相互作用進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)可視化分析和發(fā)現(xiàn)重要的相互作用。用OSPREY軟件分別對已知相互作用、Y2H獲得的相互作用、整合了兩者的相互作用進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。從所獲得的網(wǎng)絡(luò)可看出,Y2H所得到的相互作用補(bǔ)充和拓展了原有相互作用網(wǎng)絡(luò)。已報道較多相互作用的誘餌篩到新的相互作用也比較多,如STAT3,新篩到58個,(同LCI網(wǎng)絡(luò)相比)在整合網(wǎng)絡(luò)中也可看出該中心蛋白連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)變化明顯,提示了STAT3在JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中有相當(dāng)重要的作用,其轉(zhuǎn)錄活性可能受到嚴(yán)密的調(diào)控。在新發(fā)現(xiàn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)中,我們發(fā)現(xiàn)各轉(zhuǎn)錄或信號分子之間相互連接,都各自可構(gòu)成一個緊密聯(lián)系的小網(wǎng)絡(luò),兩個網(wǎng)絡(luò)都有以NR4A1為中心形成的多個三元環(huán)和四元環(huán)結(jié)構(gòu),把幾個重要轉(zhuǎn)錄因子和影響轉(zhuǎn)錄的分子聯(lián)系起來,提示NR4A1在肝臟中可能有未被充分認(rèn)識的重要作用;另外,我們的獵物和誘餌有65個蛋白已明確與疾病相關(guān),說明我們所構(gòu)建的Y2H相互作用網(wǎng)絡(luò)和整合的網(wǎng)絡(luò)可用于分析疾病的分子機(jī)制,也為未知功能蛋白給出功能提示,同時還可能發(fā)現(xiàn)已知功能蛋白的新功能。最后,通過OSPREY軟件的觀察,結(jié)合評分系統(tǒng)分析和文獻(xiàn)的查找,我們發(fā)現(xiàn)了一些可能具有重要意義的相互作用:(1)STAT3-DVL1:這對新的相互作用分子分別是經(jīng)典JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子,可能揭示了JAK-STAT和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間功能上緊密聯(lián)系的分子機(jī)制;(2)STAT3-SIAH2:這對新的相互作用可能發(fā)現(xiàn)了重要蛋白STAT3細(xì)胞核內(nèi)泛素化降解的E3連接酶。(3)JAK2-CHD3,這對新的相互作用可能揭示了JAK分子改變異染色質(zhì)功能的分子機(jī)制,并證實(shí)JAK分子改變異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的新功能。(4) STAT3-RUNX1,STAT3-NR4A1,STAT3-ZC3H12A,這些新的相互作用提示轉(zhuǎn)錄分子間直接相互交談或者形成復(fù)合物,以協(xié)同調(diào)節(jié)不同靶基因轉(zhuǎn)錄,應(yīng)對復(fù)雜信號的刺激。 總之,通過22個誘餌對正常成人肝文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩選,共獲得345對相互作用,通過回轉(zhuǎn)和評分體系分析,證實(shí)了所得的相互作用大約有50%是可信的,其中包含有系列重要的相互作用對及功能模塊,為進(jìn)一步的具體功能研究提供了重要素材,為了解細(xì)胞復(fù)雜分子機(jī)器的結(jié)構(gòu)和功能提供了寶貴資料。這是第一次大規(guī)模系統(tǒng)篩查和構(gòu)建人器官信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相互作用網(wǎng)絡(luò),所得的數(shù)據(jù)為將來研究肝臟特異調(diào)控規(guī)律和了解肝臟特殊生理功能及肝臟病理或疾病機(jī)制提供了原始素材;另外,以上策略和平臺可用于篩選、構(gòu)建和研究其它器官、組織的特異信號的相互作用網(wǎng)絡(luò)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R341

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1431499