本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向分化為神經(jīng)樣細胞的研究　出處：《廣州醫(yī)學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)后所引起的神經(jīng)源性膀胱癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,但目前尚無有效的治療手段,并且多數(shù)研究集中在尿流動力學(xué)及神經(jīng)功能損傷等方面。隨著近年來干細胞研究的突飛猛進,干細胞移植用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病并取得有效成果,甚至已經(jīng)應(yīng)用于臨床,這使通過干細胞聯(lián)合組織工程移植增加脊髓神經(jīng)數(shù)量、減少膠質(zhì)瘢痕和空洞的形成成為可能,采用干細胞接種至組織工程進行移植可望成為一種有效治療SCI后神經(jīng)源性膀胱的新方法。然而,在組織工程構(gòu)建中選擇合適的種子細胞成為治療的重要環(huán)節(jié)。全能干細胞和多能干細胞具有高度自我更新能力和多向分化的潛能,是組織工程中重要的靶細胞。胚胎干細胞移植存在倫理道德和免疫排斥等問題,神經(jīng)干細胞、嗅鞘細胞及雪旺細胞的來源均有限,且取材不便,很難應(yīng)用于臨床。BMSCs在體外具有強大的增殖能力,而且可以在不同的理化環(huán)境和細胞因子的誘導(dǎo)下向骨、脂肪、腱和肌肉等組織分化,還可以跨胚胎分化為神經(jīng)組織,展示出良好的研究和應(yīng)前用景。 實驗?zāi)康? 通過對SD大鼠BMSCs的體外分離純化和培養(yǎng)擴增,采用免疫熒光染色法對BMSCs進行形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定,并利用其生物學(xué)特性進行Nestin免疫細胞化學(xué)分析、誘導(dǎo)分化及分化鑒定,探討B(tài)MSCs定向分化為神經(jīng)樣細胞的潛能,為利用BMSCs治療SCI所引起的神經(jīng)源性膀胱提供一種理想的種子細胞和一定的理論依據(jù)。 實驗方法: 1.采用全骨髓貼壁分離法體外提取、分離及純化大鼠BMSCs,并進行傳代擴增; 2.繪制BMSCs的生長曲線,并進行免疫熒光染色觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu); 3.流式細胞分析儀檢測細胞表面抗原CD29、CD34、CD105的陽性表達率; 4.在成骨細胞誘導(dǎo)劑和神經(jīng)細胞誘導(dǎo)劑條件下定向誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞和神經(jīng)樣細胞分化,并分別行茜素紅、Nestin免疫細胞化學(xué)染色鑒定; 5.將誘導(dǎo)形成的神經(jīng)球樣細胞團進一步培養(yǎng)分化,并進行MAP-2、GFAP免疫細胞化學(xué)染色鑒定分化形成的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)。 實驗結(jié)果: 1.全骨髓貼壁分離法獲得的BMSCs在接種后24～36小時貼壁,梭形,核質(zhì)比大,呈漩渦狀生長,增殖能力強; 2.細胞生長經(jīng)過潛伏適應(yīng)期、對數(shù)增長期、平臺期階段;免疫熒光染色后在熒光顯微鏡下可見全部細胞均呈綠色熒光,細胞為梭形或多邊形,細胞核未染熒光,保持了良好的形態(tài); 3.流式細胞分析儀顯示P3～P5代細胞表面抗原CD29、CD105表達陽性,而CD34表達陰性; 4.在兩種不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下BMSCs能分化形成成骨細胞和神經(jīng)樣細胞并表達相應(yīng)的特異性抗原; 5.進一步培養(yǎng)分化所形成的細胞能表達神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2或神經(jīng)膠質(zhì)細胞標(biāo)志物GFAP。 結(jié)論: 1.全骨髓貼壁分離法可分離出較純的BMSCs,經(jīng)培養(yǎng)擴增后能獲取大量的BMSCs,細胞呈貼壁生長,增殖能力強; 2.BMSCs具有多向分化的潛能,在體外可誘導(dǎo)分化為成骨細胞及神經(jīng)樣細胞; 3.分化形成的神經(jīng)球樣細胞能進一步分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,是干細胞移植治療的理想種子細胞,具有極大的應(yīng)用前景。
[Abstract]:Spinal cord injury (spinal cord, injury, SCI) of neurogenic bladder symptoms caused by the serious influence the quality of life of patients, but there is no effective treatment, and most studies concentrated flow dynamics and nerve function injury in urine. Along with the rapid development of stem cell research, stem cell transplantation for the treatment of blood system malignant tumor, autoimmune diseases of the nervous system and achieved effective results, even has been used in clinical, which made by stem cells and tissue engineering transplantation increases the number of spinal nerves, the reduction of glial scar formation is possible, the stem cells were inoculated to tissue engineering transplant may be a new method for neurogenic bladder effectively after the treatment of SCI. However, in the construction of tissue engineering in the selection of suitable seed cells has become an important part of treatment. All stem cells and pluripotent stem Cells have self-renewal and multilineage differentiation potential, is an important target cells in tissue engineering. Embryonic stem cells exist ethical issues and immune rejection, neural stem cells, with limited sources of olfactory ensheathing cells and Schwann cells, and the sampling is inconvenient, it is difficult to apply to clinical.BMSCs has strong proliferation ability in vitro, but also fat to the bone, induced by different physical and chemical environment of cytokines, tendon and muscle tissue differentiation, can also cross the embryonic differentiation into nerve tissue, show good prospect of research and application.
Objective:
Purified and cultured by SD amplification of rat BMSCs in vitro, morphology and phenotype of BMSCs by immunofluorescence staining, and analyzed by Nestin immunocytochemistry using its biological characteristics, differentiation and differentiation, to explore the differentiation of BMSCs into neuron like cell potential, provides an ideal seed cell and a theoretical basis of neurogenic bladder caused by the use of BMSCs for the treatment of SCI.
Experimental methods:
1. the rat BMSCs was isolated and purified by the method of full bone marrow adherence separation in vitro.
2. the growth curve of BMSCs was plotted and the morphological structure was observed by immunofluorescence staining.
3. flow cytometry was used to detect the positive expression of cell surface antigen CD29, CD34 and CD105.
4., BMSCs was induced to differentiate into osteoblasts and neuron like cells under the condition of osteoblast inducers and nerve cell inducers. They were identified by alizarin red and Nestin immunocytochemical staining.
5., the induced neuron like cell clusters were further cultured and differentiated, and MAP-2 and GFAP immunocytochemical staining were used to identify the differentiated neurons and astrocytes.
Experimental results:
1. the BMSCs obtained by the full bone marrow adherence separation method was adhered to the wall 24~36 hours after inoculation, spindle shape, large nuclear substance ratio, whirlpool like growth and strong proliferation ability.
2., cell growth is in latent adaptation period, logarithmic growth stage and plateau stage. After immunofluorescence staining, all cells in the fluorescence microscope showed green fluorescence. The cells were spindle shaped or polygonal, and the nuclei were not fluorescent, and maintained a good morphology.
The 3. flow cytometry showed that the cell surface antigen of P3 to P5 was CD29, and the expression of CD105 was positive, but the expression of CD34 was negative.
4. under the induction of two different inducers, BMSCs can differentiate into osteoblasts and nerve like cells and express corresponding specific antigens.
5. the cells formed by further differentiation can express the neuron marker MAP-2 or the glial cell marker GFAP.
Conclusion:
1. the total bone marrow adherent separation method can separate the pure BMSCs. After culture amplification, a large number of BMSCs can be obtained. The cells are adhered to the wall, and the proliferation ability is strong.
2.BMSCs has the potential of multidifferentiation and can be induced to differentiate into osteoblasts and nerve like cells in vitro.
3., differentiated neuron like cells can be further differentiated into neurons and glial cells. They are ideal seed cells for stem cell transplantation, and have great potential for application.

【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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