本文關(guān)鍵詞：TLR4促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和凋亡抵抗的分子機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 臨床與流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)慢性感染和炎癥紊亂與腫瘤發(fā)生有關(guān),其中慢性炎癥促進(jìn)腫瘤免疫逃逸,被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一。近年來腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系倍受關(guān)注。研究證明,在慢性感染或炎癥條件下,TLR4誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生成大量的免疫抑制性因子抑制免疫細(xì)胞啟動(dòng)免疫應(yīng)答,同時(shí)局部感染細(xì)胞大量增殖并抵抗凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活。因此打破腫瘤免疫逃逸可能成為預(yù)防和治療腫瘤的重要手段。雷帕霉素(Rapamycin)是一種廣泛用于治療自身免疫和移植排斥疾病的免疫抑制劑,最近幾年用于治療腫瘤、抑制血管形成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此,我們提出Rapamycin這種抗炎藥物是否能夠阻斷TLR4介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,從而起到抗腫瘤的效應(yīng)。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),人HT29和鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞組成性地表達(dá)較高水平的TLR4,提示TLR4信號(hào)可能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞免疫逃逸。首先我們用RT-PCR方法檢測(cè)TLR4信號(hào)對(duì)免疫抑制因子表達(dá)譜的影響,結(jié)果顯示,LPS刺激后,LPS上調(diào)CT26細(xì)胞中IL-6和COX-2的表達(dá),隨后證明LPS刺激能夠促進(jìn)IL-6和PGE2的合成,這些因子不僅抑制免疫細(xì)胞功能而且能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和存活。然后,我們研究了Rapamycin這種抗炎藥物是否能夠抑制TLR4介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞IL-6和PGE2的生成。RT-PCR和ELISA檢測(cè)都證實(shí),在Rapamycin存在情況下,TLR4-介導(dǎo)的IL-6和COX-2表達(dá)以及IL-6和PGE2合成均顯著降低,提示Rapamycin能夠顯著抑制TLR4介導(dǎo)免疫抑制介質(zhì)的生成。 由于IL-6和PGE2是非常重要的調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和浸潤(rùn)的分子,因此,我們進(jìn)一步研究是否LPS能夠通過IL-6和PGE2自分泌促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn),以及是否Rapamycin抑制了LPS誘導(dǎo)IL-6和PGE2的產(chǎn)生,從而降低CT26細(xì)胞的活力。為了證實(shí)這一推斷,我們?cè)谙聦有∈曳謩e加入重組鼠IL-6或PGE2,發(fā)現(xiàn)外源性的IL-6和PGE2能夠逆轉(zhuǎn)Rapamycin對(duì)CT26細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的抑制效應(yīng),而且,同時(shí)加入IL-6和PGE2時(shí),幾乎全部恢復(fù)Rapamycin的上述抑制效應(yīng)。結(jié)果表明,Rapamycin能夠抑制LPS誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn),因而,在臨床治療時(shí),Rapamycin可能通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞分泌IL-6和PGE2而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的抗腫瘤效應(yīng)。 我們先前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TLR4能夠誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞的凋亡抵抗,那么Rapamycin是否能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)結(jié)腸癌的凋亡抵抗效應(yīng)呢?Annixin V/PI分析表明,LPS能夠降低OXL或DXR所誘導(dǎo)人HT29和鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Rapamycin能夠逆轉(zhuǎn)TLR4所介導(dǎo)的這一凋亡抵抗,表明Rapamycin能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性,表現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)。 Rapamycin抑制TLR4信號(hào)促進(jìn)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞IL-6、PGE2分泌并降低LPS誘導(dǎo)的凋亡抵抗。那么,其可能的分子信號(hào)機(jī)制如何呢?首先我們利用FACS對(duì)TLR4受體膜表面的表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Rapamycin能夠抑制TLR4在細(xì)胞膜上的表達(dá),但對(duì)TLR4的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響,提示Rapamycin可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)如抑制TLR4的糖基化或向胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程而降低膜表面的表達(dá),Rapamycin介導(dǎo)TLR4的下調(diào)可能削弱了LPS所誘導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。隨后我們對(duì)TLR4介導(dǎo)的MAPKs、Akt和NF-κB信號(hào)途徑進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在CT26細(xì)胞中,Rapamycin對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAPKs激酶p38、ERK1/2、JNK1/2的活化沒有影響,但顯著抑制了Akt的磷酸化及NF-κB信號(hào)途徑。提示Rapamycin可能通過抑制這兩條信號(hào)通路從而抑制IL-6和PGE2的合成及凋亡抵抗逆轉(zhuǎn)。為了證實(shí)這一點(diǎn),Akt和NF-κB信號(hào)分子特異性的抑制劑LY209400及PDTC處理阻斷信號(hào)后,ELISA檢測(cè)免疫抑制性因子的生成,結(jié)果顯示與Rapamycin相似,LY209400及PDTC均能有效抑制IL-6和PGE2的分泌;同樣地,LY209400及PDTC均能有效逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)腫瘤藥物OXL和DXR的抵抗作用。可推斷Rapamycin作用于Akt和NF-κB信號(hào)分子抑制TLR4介導(dǎo)的CT26分泌IL-6和PGE2及OXL和DXR誘導(dǎo)的凋亡抵抗。 以上研究結(jié)果顯示,Rapamycin作用于Akt和NF-κB信號(hào)分子打破腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,Rapamycin是PI3K/Akt通路有效的抑制劑,但對(duì)于NF-κB抑制機(jī)制還不清楚。眾所周知,I-κB的磷酸化及降解促進(jìn)NF-κB的核轉(zhuǎn)位。I-κB上游的激酶為IKKα/β,IKKα/β是Akt的調(diào)節(jié)靶分子,這些通路參與對(duì)外界的炎癥應(yīng)答。我們發(fā)現(xiàn)LY209400(Akt的抑制劑)與Rapamycin一樣均能夠抑制IKKα/β和NF-κB的活化,說明Rapamycin通過抑制LPS誘導(dǎo)的Akt/IKKα/β/NF-κB的級(jí)聯(lián)信號(hào)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞免疫逃逸和轉(zhuǎn)移。 綜上所述,Rapamycin能夠降低結(jié)腸癌TLR4膜表面的表達(dá)和抑制Akt/IKKα/β/NF-κB級(jí)聯(lián)通路,從而抑制了TLR4介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自分泌IL-6和PGE2及其所誘導(dǎo)的腫瘤遷移和浸潤(rùn),并逆轉(zhuǎn)了TLR4所介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡抵抗。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從新的角度解釋了Rapamycin通過抑制參與免疫逃逸的因子的形成及增強(qiáng)抗腫瘤藥物敏感性從而打破免疫逃逸以發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),進(jìn)一步提示了Rapamycin可用于結(jié)腸癌的治療。 目前,腫瘤治療主要依賴于手術(shù)、放療和化療,然而,臨床觀察發(fā)現(xiàn),在某些情況下,放化療可以促進(jìn)肝癌發(fā)展,然而其內(nèi)在機(jī)制依然不明。因此,為了提高治療效果,探究在治療過程中HCC的生物學(xué)功能及腫瘤惡化機(jī)制尤為重要。本文所研究旨在探討在放療或生物治療過程中,肝癌的免疫逃逸和發(fā)展機(jī)制。 諸多研究表明,腫瘤微環(huán)境中,持續(xù)的炎癥刺激和慢性感染導(dǎo)致或促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。近年來發(fā)現(xiàn),表達(dá)于腫瘤中的TLR4受體通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放免疫抑制性的因子和凋亡抵抗從而介導(dǎo)免疫逃逸。 高頻率重組蛋白-1(High-mobility group box-1,HMGB1)最初被鑒定為DNA體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控協(xié)同因子。免疫刺激時(shí),炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞被活化導(dǎo)致HMGB1被包裝到溶酶體然后釋放到胞外環(huán)境;壞死或受損的體細(xì)胞以被動(dòng)的方式釋放HMGB1。一旦釋放到胞外,HMGB1發(fā)揮致炎因子作用活化內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管形成,炎癥細(xì)胞和干細(xì)胞向血管外的遷移,通過活化一系列關(guān)鍵信號(hào)途徑從而啟動(dòng)炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化、生長(zhǎng)及死亡。因此,HMGB1涉及到多種疾病,包括帕?xí)�、膿血癥、缺血再灌注及自身免疫疾病。HMGB1到胞外環(huán)境且與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近研究表明,HMGB1與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān),而且,HMGB1是TLR4的內(nèi)源性配體,因此,我們研究了在放療和生物治療過程中由壞死細(xì)胞釋放的HMGB1是否能夠作為一個(gè)旁分泌因子促進(jìn)肝癌的發(fā)展。 我們研究發(fā)現(xiàn),在放療和TRAIL治療過程中,源于死亡的肝癌細(xì)胞株SMMC-7721上清能夠誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)免疫抑制性細(xì)胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1。為了確定是否死亡細(xì)胞釋放的HMGB1誘導(dǎo)了這種炎癥效應(yīng),我們干擾了SMMC-7221細(xì)胞HMGB1,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HMGB1干擾的壞死細(xì)胞的上清對(duì)MIP-3α的誘導(dǎo)能力顯著減弱,證實(shí)了死亡細(xì)胞釋放HMGB1并將信號(hào)傳遞于其周邊細(xì)胞。重組的HMGB1也能促進(jìn)高水平MIP-3α的表達(dá),進(jìn)一步表明了上清中的HMGB1促進(jìn)了免疫抑制性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。為了明確HMGB1是由凋亡細(xì)胞還是壞死細(xì)胞釋放HMGB1,利用放射和TRAIL處理SMMC-7721,Annixin V/PI凋亡檢測(cè)表明,是死亡細(xì)胞而非凋亡細(xì)胞釋放的HMGB1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,因?yàn)樵从谒劳黾?xì)胞的上清能夠促進(jìn)SMMC-7721表達(dá),但凋亡細(xì)胞上清不能誘導(dǎo)其表達(dá)。這些研究結(jié)果表明,在放療和TRAIL治療過程中,死亡肝癌細(xì)胞上清中所含的HMGB1促進(jìn)了免疫抑制過程。 由于HMGB1能夠介導(dǎo)神經(jīng)節(jié)瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散,所以我們研究了HMGB1和死亡細(xì)胞上清是否能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HMGB1能夠促進(jìn)SMMC-7721增殖,BrdU參入法檢測(cè)細(xì)胞增殖進(jìn)一步證實(shí)死亡細(xì)胞上清和HMGB1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。然后,我們研究了是否HMGB1通過加速細(xì)胞周期進(jìn)程從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期分析表明,重組HMGB1加速G1向S期的轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,由于放療和化療誘導(dǎo)死亡細(xì)胞可能通過釋放高水平HMGB1加速細(xì)胞周期進(jìn)程從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和惡化。 由于細(xì)胞周期素A,D和E是G1向S相轉(zhuǎn)化所必需分子,然后利用蛋白印記方法檢測(cè)是否HMGB1影響細(xì)胞周期素A,D,E的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn),HMGB1刺激SMMC-7721后,細(xì)胞周期素cyclinD的表達(dá)顯著增加,但對(duì)細(xì)胞周期素A和E的表達(dá)沒有影響。另外,因?yàn)閜53、p21和p27都是負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的分子,因此我們推測(cè)可能這些分子在這一過程中發(fā)揮重要作用。Western blot顯示HMGB1顯著下調(diào)p27的表達(dá),但不影響p21和p53的表達(dá)。因?yàn)橹挥衟27在T187位點(diǎn)的磷酸化能被泛素化并被蛋白酶體識(shí)別,因此我們檢測(cè)了是否HMGB1影響p27的磷酸化。Western blot表明,HMGB1刺激后,SMMC-7721細(xì)胞中p27—T187磷酸化顯著增加。綜合以上結(jié)果,提示下調(diào)p27及增強(qiáng)cyclinD可能是HMGB1加速肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的機(jī)制之一。 在治療腫瘤的過程中,最主要的瓶頸之一是對(duì)抗腫瘤藥物的耐受從而不能殺傷腫瘤。我們推測(cè)HMGB1可能參與腫瘤的抗凋亡效應(yīng)。SMMC-7721細(xì)胞用HMGB1預(yù)處理,然后TRAIL再行行刺激,Annixin V/PI分析發(fā)現(xiàn),HMGB1降低了TRAIL所誘導(dǎo)SKMC-7721的凋亡。為了進(jìn)一步闡明HMGB1導(dǎo)致凋亡抵抗效應(yīng)的機(jī)制,用蛋白印跡檢測(cè)了促調(diào)亡和抗凋亡蛋白,我們發(fā)現(xiàn),HMGB1刺激SMMC-7721后,抗凋亡蛋白Bcl-xL顯著上調(diào),但Bcl-2、Bax或Bak沒有變化。這些結(jié)果提示,HMGB1誘導(dǎo)Bcl-xL表達(dá)很可能是其促進(jìn)肝癌細(xì)胞逃避TRAIL誘導(dǎo)的凋亡從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞存活的機(jī)制之一。 如前面所述,重組HMGB1和源于死亡細(xì)胞的上清能夠促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞免疫抑制細(xì)胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α,IP-10和MCP-1的表達(dá)。另外,HMGB1是TLR4內(nèi)源性配體,因而,為了進(jìn)一步證實(shí)HMGB1是否通過TLR4/MyD88信號(hào)途徑而介導(dǎo)免疫逃逸的誘導(dǎo),我們構(gòu)建了針對(duì)于SMMC-7721細(xì)胞TLR4和MyD88的干擾載體。RT-PCR檢測(cè)表明,HMGB1或死亡細(xì)胞上清處理TLR4或MyD88缺陷的SMMC-7721細(xì)胞后,對(duì)MIP-3αmRNA誘導(dǎo)表達(dá)能力顯著降低,說明重組的HMGB1和死亡細(xì)胞的上清介導(dǎo)MIP-3α表達(dá)依賴于TLR4/MyD88信號(hào)途徑。 另外,與LPS刺激相似,HMGB1能夠活化SMMC-7721細(xì)胞p38MAPK、ERK1/2、JNK和NF-κB信號(hào)通路。因此,我們研究了HMGB1是否通過MAPK或NF-κB參與細(xì)胞周期和凋亡抵抗的調(diào)節(jié)。Western blot檢測(cè)表明MEK1/2(PD98059)和ERK1/2(U0126)抑制劑能夠顯著抑制HMGB1誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞p27磷酸化及其降解以及周期素D1的表達(dá)。而NF-κB抑制劑PDTC下調(diào)HMGB1所誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)。因此,HMGB1/TLR4誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化是由MEK1/2/ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo),而N-κB是促進(jìn)HMGB1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡抵抗的關(guān)鍵信號(hào)分子。因此,HMGB1/TLR4信號(hào)介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡抵抗和加速細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化過程,從而促進(jìn)肝癌免疫逃逸和進(jìn)一步發(fā)展。 綜上所述,由30 Gy-co-ray放療或TRAIL處理所導(dǎo)致死亡的肝癌細(xì)胞的分泌上清能夠反饋性地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1,死亡的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞釋放的HMGB1介導(dǎo)了此種效應(yīng)。HMGB1通過增強(qiáng)cyclinD表達(dá)及p27-T187磷酸化和降解而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞G1—S期的進(jìn)程。另外,HMGB1可通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的抵抗,提示,放化療導(dǎo)致死亡的肝癌細(xì)胞釋放的HMGB1參與了腫瘤的逃避免疫和凋亡抵抗。干擾HMGB1或TLR4/MyD88之后,死亡的肝癌細(xì)胞以及重組HMGB1均不能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)MIP-3α,進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1/TLR4/MyD88途徑依賴的放化療促進(jìn)肝癌的免疫逃逸作用。因此,我們研究結(jié)果提供的實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接證明了在放化療過程中壞死的肝癌細(xì)胞能夠通過釋放HMGB1并通過TLR4/MyD88依賴途徑介導(dǎo)了肝癌免疫逃逸和凋亡抵抗,提示通過中和或干擾肝癌細(xì)胞中HMGB1并與化療聯(lián)合應(yīng)用可能有助于肝癌的治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R730.2

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本文編號(hào)：1409049