本文關(guān)鍵詞：問號鉤端螺旋體粘附侵襲相關(guān)基因mce功能鑒定　出處：《浙江大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 背景和目的:鉤端螺旋體(簡稱鉤體)病是全世界范圍內(nèi)流行的,由致病性鉤體感染引起的人獸共患傳染病。據(jù)估計,全世界每年有超過500,000的鉤端螺旋體感染病例,死亡率達5～20%。鉤體病的致病機制至今未明是對鉤體病加以有效控制的主要障礙。鉤體可分為致病性的問號鉤體和非致病的腐生性雙曲鉤體,前者感染人或動物后可引起鉤端螺旋體病。黏附入侵巨噬細胞是致病性鉤體的主要特性之一。問號鉤體強大的侵襲力使其能迅速穿越人、動物皮膚或黏膜侵入血流引起鉤體血癥,故問號鉤體的粘附侵襲力與其致病性密切相關(guān),但其分子機制不明。雖然有文獻報道問號鉤體可以粘附侵入小鼠單核巨噬樣細胞(J774A.1),并且推測mce基因可能與問號鉤體粘附侵入巨噬細胞相關(guān),然而mce基因的功能至今仍未得到證實。本研究旨在確定各問號鉤體菌株攜帶粘附侵襲相關(guān)基因mce的情況,了解問號鉤體感染細胞前后mce基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。通過原核表達rMce并制備其抗血清,分析兔抗rMce血清是否能夠抑制問號鉤體的粘附小鼠單核巨噬樣細胞(J774A.1)。并通過同源重組的方法構(gòu)建問號鉤體mce缺失突變株,在細胞模型中進一步證實問號鉤體mce基因是否具有粘附侵襲功能。 實驗方法:采用PCR擴增我國15群15型問號鉤體參考標準株和2株雙曲鉤體全長mce基因片段,T-A克隆后測序。采用基因工程技術(shù)構(gòu)建問號鉤體賴株mce基因原核表達系統(tǒng)。SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查目的重組蛋白rMce表達情況。通過Ni-NTA親和層析法提純表達的目的重組蛋白。采用皮內(nèi)多點注射免疫法制備兔抗rMce血清并通過Western Blot對表達的rMce進行鑒定。采用實時熒光定量RT-PCR法檢測問號鉤體賴株感染小鼠單核巨噬樣細胞后,mce基因在不同時間點轉(zhuǎn)錄水平上的變化。通過同源重組,將問號鉤體賴株mce基因靶向敲除。采用細胞模型,通過Fontana銀染法、雙熒光染色法,分析兔抗rMce血清對問號鉤體粘附宿主細胞的阻斷作用以及問號鉤體賴株mce基因缺失突變株粘附和侵襲小鼠單核巨噬樣細胞能力的變化。 結(jié)果:我國15株問號鉤體株均攜帶mce基因,雙曲鉤體則否。與報道的問號鉤體賴株mce基因序列(GenBank accession No.:NP_712236)比較,所克隆的各菌株mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為99.0%～100%和97.9%～100%。所構(gòu)建的mce基因原核表達系統(tǒng)能表達rMce,其產(chǎn)量約為細菌總蛋白的5%。問號鉤體賴株全菌兔抗血清和兔抗rMce血清均能有效識別rMce并阻斷問號鉤體粘附J774A.1細胞。問號鉤體賴株感染小鼠單核巨噬樣細胞30、60、90、120分鐘后,mce基因轉(zhuǎn)錄水平最高上調(diào)6.10倍(P＜0.05)。通過同源重組成功構(gòu)建了問號鉤體賴株的mce基因缺失突變株。Fontana銀染法和熒光分光光度法檢測結(jié)果顯示,問號鉤體賴株mce基因缺失突變株對小鼠單核巨噬樣細胞的黏附能力和侵襲能力比野生株分別降低了59.8%和72.7%(P＜0.05)。 結(jié)論:mce基因僅存在于致病性的問號鉤體中,mce基因產(chǎn)物是序列保守的外膜蛋白。所構(gòu)建的mce基因原核表達系統(tǒng)能很好地表達rMce蛋白,所制備的rMce抗血清能有效阻斷問號鉤體粘附宿主細胞。問號鉤體感染小鼠單核巨噬樣細胞后,mce基因轉(zhuǎn)錄水平呈細胞接觸上調(diào)模式。問號鉤體賴株mce基因缺失突變株對小鼠單核巨噬樣細胞的黏附能力和侵襲能力與野生株相比下降明顯,表明該基因與問號鉤體致病性密切相關(guān)。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : The disease of leptospirosis is epidemic in the world . It is estimated that there are more than 500,000 leptospirosis cases in the world , and the mortality rate is 5 锝，

本文編號：1408861