本文關(guān)鍵詞：問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體粘附侵襲相關(guān)基因mce功能鑒定　出處：《浙江大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 背景和目的:鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)病是全世界范圍內(nèi)流行的,由致病性鉤體感染引起的人獸共患傳染病。據(jù)估計(jì),全世界每年有超過(guò)500,000的鉤端螺旋體感染病例,死亡率達(dá)5～20%。鉤體病的致病機(jī)制至今未明是對(duì)鉤體病加以有效控制的主要障礙。鉤體可分為致病性的問(wèn)號(hào)鉤體和非致病的腐生性雙曲鉤體,前者感染人或動(dòng)物后可引起鉤端螺旋體病。黏附入侵巨噬細(xì)胞是致病性鉤體的主要特性之一。問(wèn)號(hào)鉤體強(qiáng)大的侵襲力使其能迅速穿越人、動(dòng)物皮膚或黏膜侵入血流引起鉤體血癥,故問(wèn)號(hào)鉤體的粘附侵襲力與其致病性密切相關(guān),但其分子機(jī)制不明。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道問(wèn)號(hào)鉤體可以粘附侵入小鼠單核巨噬樣細(xì)胞(J774A.1),并且推測(cè)mce基因可能與問(wèn)號(hào)鉤體粘附侵入巨噬細(xì)胞相關(guān),然而mce基因的功能至今仍未得到證實(shí)。本研究旨在確定各問(wèn)號(hào)鉤體菌株攜帶粘附侵襲相關(guān)基因mce的情況,了解問(wèn)號(hào)鉤體感染細(xì)胞前后mce基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。通過(guò)原核表達(dá)rMce并制備其抗血清,分析兔抗rMce血清是否能夠抑制問(wèn)號(hào)鉤體的粘附小鼠單核巨噬樣細(xì)胞(J774A.1)。并通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建問(wèn)號(hào)鉤體mce缺失突變株,在細(xì)胞模型中進(jìn)一步證實(shí)問(wèn)號(hào)鉤體mce基因是否具有粘附侵襲功能。 實(shí)驗(yàn)方法:采用PCR擴(kuò)增我國(guó)15群15型問(wèn)號(hào)鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株和2株雙曲鉤體全長(zhǎng)mce基因片段,T-A克隆后測(cè)序。采用基因工程技術(shù)構(gòu)建問(wèn)號(hào)鉤體賴株mce基因原核表達(dá)系統(tǒng)。SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查目的重組蛋白rMce表達(dá)情況。通過(guò)Ni-NTA親和層析法提純表達(dá)的目的重組蛋白。采用皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫法制備兔抗rMce血清并通過(guò)Western Blot對(duì)表達(dá)的rMce進(jìn)行鑒定。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)問(wèn)號(hào)鉤體賴株感染小鼠單核巨噬樣細(xì)胞后,mce基因在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平上的變化。通過(guò)同源重組,將問(wèn)號(hào)鉤體賴株mce基因靶向敲除。采用細(xì)胞模型,通過(guò)Fontana銀染法、雙熒光染色法,分析兔抗rMce血清對(duì)問(wèn)號(hào)鉤體粘附宿主細(xì)胞的阻斷作用以及問(wèn)號(hào)鉤體賴株mce基因缺失突變株粘附和侵襲小鼠單核巨噬樣細(xì)胞能力的變化。 結(jié)果:我國(guó)15株問(wèn)號(hào)鉤體株均攜帶mce基因,雙曲鉤體則否。與報(bào)道的問(wèn)號(hào)鉤體賴株mce基因序列(GenBank accession No.:NP_712236)比較,所克隆的各菌株mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為99.0%～100%和97.9%～100%。所構(gòu)建的mce基因原核表達(dá)系統(tǒng)能表達(dá)rMce,其產(chǎn)量約為細(xì)菌總蛋白的5%。問(wèn)號(hào)鉤體賴株全菌兔抗血清和兔抗rMce血清均能有效識(shí)別rMce并阻斷問(wèn)號(hào)鉤體粘附J774A.1細(xì)胞。問(wèn)號(hào)鉤體賴株感染小鼠單核巨噬樣細(xì)胞30、60、90、120分鐘后,mce基因轉(zhuǎn)錄水平最高上調(diào)6.10倍(P＜0.05)。通過(guò)同源重組成功構(gòu)建了問(wèn)號(hào)鉤體賴株的mce基因缺失突變株。Fontana銀染法和熒光分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示,問(wèn)號(hào)鉤體賴株mce基因缺失突變株對(duì)小鼠單核巨噬樣細(xì)胞的黏附能力和侵襲能力比野生株分別降低了59.8%和72.7%(P＜0.05)。 結(jié)論:mce基因僅存在于致病性的問(wèn)號(hào)鉤體中,mce基因產(chǎn)物是序列保守的外膜蛋白。所構(gòu)建的mce基因原核表達(dá)系統(tǒng)能很好地表達(dá)rMce蛋白,所制備的rMce抗血清能有效阻斷問(wèn)號(hào)鉤體粘附宿主細(xì)胞。問(wèn)號(hào)鉤體感染小鼠單核巨噬樣細(xì)胞后,mce基因轉(zhuǎn)錄水平呈細(xì)胞接觸上調(diào)模式。問(wèn)號(hào)鉤體賴株mce基因缺失突變株對(duì)小鼠單核巨噬樣細(xì)胞的黏附能力和侵襲能力與野生株相比下降明顯,表明該基因與問(wèn)號(hào)鉤體致病性密切相關(guān)。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : The disease of leptospirosis is epidemic in the world . It is estimated that there are more than 500,000 leptospirosis cases in the world , and the mortality rate is 5 锝，

本文編號(hào)：1408861