發(fā)布時間：2018-01-09 03:19

  本文關(guān)鍵詞：整合子捕獲基因盒效率調(diào)控機制研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 整合子 整合酶 耐藥性 基因重組 側(cè)向基因轉(zhuǎn)移

【摘要】： 目前細菌的耐藥性非常嚴(yán)重,尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)是對臨床細菌感染性疾病治療的一個巨大挑戰(zhàn)。耐單種抗生素的菌株的出現(xiàn)可能在人們的預(yù)料之中,可能是基因突變造成的結(jié)果,那么在同一菌株中同時出現(xiàn)對多種抗生素的耐藥性,就很難用基因突變來解釋�，F(xiàn)在研究證明遺傳物質(zhì)在菌種內(nèi)以及菌種間的水平傳播,是細菌獲得新的耐藥性的重要手段。在對一組來自社區(qū)并且至少在一個月未服用抗生素的健康人群進行研究,所分離到的大腸桿菌中整合子的出現(xiàn)頻率為15%。Jones等人的研究表明攜帶有整合子的菌株要比不攜帶整合子的菌株更容易產(chǎn)生對多種抗生素的耐藥性。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)70多種耐藥性基因盒。這些資料說明整合子在耐藥基因的水平傳播以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)中起重要作用。 整合子在某些情況下通過捕獲有利的基因盒,比如耐藥性基因盒而獲得生存優(yōu)勢,但也有可能捕獲某些對宿主產(chǎn)生毒性的基因盒而造成不利的影響,或者過度捕獲基因盒而對宿主菌的繁殖造成一定負(fù)擔(dān)。因此,細菌的整合子在捕獲外來基因盒的過程中,一定有一套完整而又精細的調(diào)節(jié)機制,但這一機制仍未明了。對于這一機制的研究,有助于加深理解整合子在耐藥基因的水平傳播中的作用,對于臨床上開發(fā)有效的藥物來阻斷或延緩這一過程提供有益的幫助。同時,為利用整合子捕獲基因盒定點、定向的特性,將其開發(fā)為一種基因重組工具奠定基礎(chǔ)。為此,我們將從四個方面研究影響整合子捕獲基因盒的因素,分別是宿主因子、基因盒本身,主要是基因盒長度、外界環(huán)境因素,主要是抗生素的濃度、整合酶表達水平。 1.測定整合子捕獲基因盒效率的新方法的建立 以前廣泛使用的測定整合酶所催化的重組反應(yīng)的效率,是利用接合實驗用表型篩選的辦法來進行。這種方法操作麻煩、費時、相對的精密度低,不便于整合子捕獲基因盒機制的深入研究。因此我們建立了一種基于熒光定量PCR技術(shù),從分子水平來測定整合頻率的方法。首先我們用pUC19為載體構(gòu)建了高表達整合酶的重組質(zhì)粒pUCINT,隨后我們在pACYC184載體的不同位置分別插入了整合子以及aadA2基因盒,該重組質(zhì)粒命名為pACINAD,將這兩種相容的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),過夜培養(yǎng)后用熒光定量PCR技術(shù)測定發(fā)生整合作用的整合子的拷貝數(shù)和總的整合子的拷貝數(shù),前者除以后者即為整合頻率。結(jié)果在大腸桿菌BL21(DE3)宿主中所測得的整合頻率為1.87×10~(-4),CV值為24.6%,而在沒有整合酶高表達的情況下的背景整合頻率低于5.23×10~(-8)。該方法的建立為后續(xù)深入研究整合子捕獲基因盒的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。 2.宿主因子對于整合效率影響的研究 現(xiàn)有資料提示,整合子在捕獲基因盒的過程中可能還有其它宿主因子的參與,目前還沒有這方面的具體研究。為此我們利用轉(zhuǎn)座子,對同時含有重組質(zhì)粒pUCINT和pACINAD的大腸桿菌BL21(DE3),建立插入突變文庫。利用前述方法對該突變文庫進行篩選,找到一株整合頻率較其相應(yīng)野生株提高26倍的突變株,將其命名為TIM。利用大腸桿菌基因芯片對該突變株和其相應(yīng)野生株表達有差異的基因進行篩選,結(jié)果檢測到表達有差異的基因共有52個,其中上調(diào)基因33個,下調(diào)基因19個。涉及到原噬菌體DLP12共有8個,這些基因表達均上調(diào),它們分別為ybcT、peaD′、ybcW、exoD′、ybcX、nohB、renD′、ybcV。這引起了我們的重視,因為現(xiàn)有資料也表明存在于眾多細菌染色體上的原噬菌體,與我們所研究的整合子同樣是細菌基因組進化的重要工具。利用熒光定量PCR技術(shù)對上述部分基因的表達水平進行驗證,結(jié)果與基因芯片的檢測數(shù)據(jù)相符。進一步的研究表明ybcV、ybcW和nohB基因?qū)φ戏磻?yīng)具有一定的促進作用。 3.基因盒長度對于整合效率的影響 到目前為止,有關(guān)整合酶介導(dǎo)的對基因盒的切除和整合作用的確切機制仍未明了。整合子中存在臨床上所使用的絕大多數(shù)抗生素耐藥性基因,然而其中有關(guān)的基因盒長度很少超過1kb。因此我們假設(shè)長度不超過1 kb的基因盒是整合酶所催化的重組反應(yīng)的最適底物。為此我們構(gòu)建了一系列攜帶有相同attC位點但長度不同的基因盒的重組質(zhì)粒。在論文第一部分所建立的方法基礎(chǔ)之上,測定了整合酶所催化的對上述不同長度的基因盒的切除和整合頻率。結(jié)果顯示切除頻率波動在3.08×10~(-2)和1.08×10~(-2)之間,而沒有整合酶高表達的背景頻率低于2.38×10~(-7)。通過對PCR產(chǎn)物的序列測定表明,切除是通過兩個attC位點的重組反應(yīng)而發(fā)生。這些數(shù)據(jù)顯示整合酶介導(dǎo)的對于不同長度的基因盒的切除頻率差別不大。對于在質(zhì)粒pACZC上攜帶的基因盒的切除頻率僅為在質(zhì)粒pSA24上攜帶的基因盒的切除頻率的2.4倍,而后者基因盒的長度大約是前者基因盒的長度的7倍。反映出整合酶所催化的切除反應(yīng),對于基因盒長度變化不敏感。而對于上述不同長度基因盒的整合頻率波動在8.18×10~(-5)和1.39×10~(-6)之間,隨著基因盒長度的增加,整合頻率明顯地降低,基因盒的長度對整合酶所催化的整合效率影響較大。這些研究結(jié)果提示,在整合子捕獲基因盒的過程中,整合作用可能為其限速步驟。同時我們證明隨著基因盒長度的增加,基因盒的切除頻率僅輕度降低,而整合頻率則大幅度降低。反映了由整合酶所催化的分子內(nèi)重組反應(yīng)要比分子間重組反應(yīng)容易的多,過長的基因盒可能影響整合酶和其DNA底物之間所形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性。 4.抗生素濃度對于整合效率的影響 整合子捕獲基因盒具有隨機性,在環(huán)境的強大選擇壓力下,最終獲得最有利于宿主菌生存的基因盒排列和組成方式的細菌被保留下來。在臨床中所分離到的整合子中的絕大多數(shù)基因盒,都是編碼對已知抗生素的抗性,這可能與抗生素在臨床上的廣泛使用有關(guān)。但是到目前為止還沒有整合酶催化的重組反應(yīng)的效率和抗生素濃度的關(guān)系的報道。為此,我們把在第三位置含有一aadA2基因盒的整合子克隆到質(zhì)粒pACYC184。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化高表達整合酶的大腸桿菌BL21(DE3)后,加入不同濃度的鏈霉素過夜培養(yǎng)后,利用論文第一部分所建立的方法測定aadA2基因盒在attI位點的重組效率。結(jié)果顯示在沒有整合酶高表達的情況下的背景頻率低于1.75×10~(-7)。在高表達整合酶的情況下,aadA2基因盒能夠在整合子的attI位點發(fā)生重組,但重組頻率變化較大,隨著鏈霉素濃度的增加整合頻率從1.97×10~(-3)增加到1.32。表明一定濃度的抗生素能夠影響整合頻率。用Western blotting進一步證實,aadA2基因盒在attI位點的表達水平大約是其在整合子的第三位置表達水平的10倍。 5.整合酶表達水平對于整合效率的影響 如前所述在一定范圍內(nèi)提高整合酶的表達水平可以使整合頻率顯著提高,但是在此基礎(chǔ)上再進一步提高整合酶的表達水平,是否會使整合頻率進一步提高呢?我們測定了克隆在pUC19質(zhì)粒上的整合酶基因在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下,所催化的對基因盒的整合頻率。測定結(jié)果顯示在不同的誘導(dǎo)劑濃度下,整合頻率并未見顯著的變化。為了更進一步證實這一現(xiàn)象,我們也測定了克隆在pET28a質(zhì)粒上的整合酶基因在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下,所催化的對基因盒的整合頻率。測定結(jié)果顯示在不同的誘導(dǎo)劑濃度下,整合頻率同樣未見明顯的變化。SDS-PAGE顯示克隆在pET28a質(zhì)粒上的整合酶基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,表達明顯提高,最后用Western blotting也證實了這點。這說明整合酶表達水平并不是決定其所介導(dǎo)的整合反應(yīng)效率的唯一因素,也可能其它諸如基因盒attC位點以單鏈形式存在的整體水平、整合酶四聚體的穩(wěn)定性等方面,對于整合反應(yīng)也有一定的影響作用。
[Abstract]:The drug resistance of bacteria is very serious , especially the emergence of multiple drug resistant strains is a great challenge for the treatment of infectious diseases of clinical bacteria . It is very difficult to explain the drug resistance of antibiotics . Therefore , it is necessary to study the factors that affect the gene cassette of the integron in the process of capturing foreign gene cassettes , which can help to deepen understanding of the role of integron in the horizontal propagation of drug resistant genes . 1 . Establishment of a new method for determining the efficiency of an integrated sub - capture gene cassette In this paper , we constructed a recombinant plasmid pACINAD , which was used to measure the integration frequency from the molecular level . The results showed that the integration frequency was 1 . 87 脳 10 ~ ( -4 ) , CV value was 24 . 6 % , and the integration frequency was lower than 5.23 脳 10 ~ ( -8 ) . 2 . Study on the Impact of Host Factors on Integration Efficiency In this paper , we used transposon to screen the mutant strain and its corresponding wild strain to raise 26 times . The results showed that there were 52 genes with different integration frequency . The results showed that the gene expression level of the mutant strain and its corresponding wild strain was raised by 26 times . 3 . Effect of gene cassette length on integration efficiency In this paper , we have constructed a series of recombinant plasmids carrying the gene cassette with different length . The results show that the excision frequency of the gene cassette is only about 7 times the length of the gene cassette . The results show that the excision frequency of the gene cassette is only about 7 times the length of the gene cassette . 4 . Effect of antibiotic concentration on integration efficiency coli BL21 ( DE3 ) with high expression of integration enzyme . The results showed that the expression level of aadA2 gene cassette at attI site was about 10 times higher than that at the third position of integron . 5 . Effect of integration enzyme expression level on integration efficiency The results showed that the integration frequency was not significantly changed at different concentrations of IPTG . The results showed that the integration frequency was not changed significantly at different concentrations of IPTG .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R515;R346

【共引文獻】

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本文編號：1399804