本文關(guān)鍵詞：載脂蛋白M重組蛋白和單克隆抗體的制備及其初步臨床應(yīng)用　出處：《中南大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 載脂蛋白M 基因克隆 重組蛋白 蛋白純化 載脂蛋白M 單克隆抗體 抗體的制備 應(yīng)用 載脂蛋白M 雙抗體夾心法 血脂 冠心病

【摘要】： 第一部分人載脂蛋白M的表達(dá)與純化 研究背景： 人載脂蛋白M (apolipoprotein M, apoM)是新發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白,屬于疏水性分子結(jié)合蛋白家族,主要存在于HDL中。動(dòng)物和細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果表明,apoM通過參與前β-HDL的形成,促進(jìn)體內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的過程,同時(shí)還具抗炎和抗氧化的作用。因此,認(rèn)為apoM具有抗動(dòng)脈粥樣硬化功效,但其抗動(dòng)脈粥硬化作用機(jī)制目前還不十分清楚。由于apoM是一種小分子的載脂蛋白,分子量?jī)H24kD,且成熟分子中的疏水信號(hào)肽介導(dǎo)該蛋白“錨著”在磷脂單層上,直接從血清中提取apoM蛋白較困難。本研究擬通過基因工程手段,體外表達(dá)apoM重組蛋白,而制備抗apoM的單克隆抗體,為apoM蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究打下基礎(chǔ)。 目的： 重組表達(dá)人全長(zhǎng)apoM蛋白并將其純化,得到濃度高、純度好的重組apoM蛋白。 方法： 利用人類肝臟cDNA文庫(kù)做模板,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增apoMDNA,將擴(kuò)增正確的目的基因片段插入載體pET相應(yīng)位點(diǎn),轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109進(jìn)行克隆,挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行基因測(cè)序；再用測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌E.coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)；用親和純化的方法純化大腸桿菌表達(dá)的目的蛋白,并用SDS-PAGE凝膠電泳、Westren印跡及Lowry蛋白定量的方法對(duì)蛋白質(zhì)的含量、純度及特性進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)擴(kuò)增出一條特異的560bp的基因片段,測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的人apoM基因序列完全一致。 2、成功構(gòu)建了pET-apoM質(zhì)粒。經(jīng)BamH I和XhoⅠ做雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)2條特異性的條帶,其中1條與酶切前質(zhì)粒位置相近,另1條與目的基因大小基本一致。 3、含重組質(zhì)粒pET-apoM的大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)重組蛋白,SDS-PAGE電泳分析表明在相對(duì)分子量34kD左右出現(xiàn)新的蛋白條帶,與目的蛋白分子量一致。 4、用親和層析的方法純化后的Trx-apoM重組蛋白,SDS-PAGE電泳表明純度高,無明顯雜帶。 5、用抗Thioredoxin (Trx)抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)證實(shí),該重組蛋白為Thioredoxin (Trx)融合蛋白。 結(jié)論： 本研究成功克隆出人apoM基因,并表達(dá)出Trx-apoM重組蛋白。通過克隆表達(dá)人apoM蛋白,一方面可以將其作為抗原制備針對(duì)apoM的抗體,從而可以進(jìn)一步開發(fā)人體血液中apoM含量的檢測(cè)試劑盒,為臨床研究和診斷提供工具；另一方面,可以對(duì)表達(dá)的apoM進(jìn)行理化處理,在細(xì)胞和動(dòng)物模型上對(duì)apoM的功能進(jìn)行研究,從而進(jìn)一步研究apoM在人體脂類代謝中的生理功能。 第二部分載脂蛋白M單克隆抗體的制備及其鑒定 研究背景： 載脂蛋白M (apoM)由于其基因結(jié)構(gòu)和組織分布特點(diǎn),被認(rèn)為其可在抗動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用；對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識(shí),有助于揭示其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制,從而對(duì)疾病的預(yù)防及治療起著重要的推動(dòng)作用。抗體作為研究工作中的探針,可以從分子、細(xì)胞和器官等不同水平上,研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；還能作為親合層析的配體,固定在層析柱上,通過親合層析從復(fù)雜的混和物中分離、純化某種蛋白,是蛋白質(zhì)功能研究的基本手段。利用雜交瘤技術(shù)制備抗體,是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域常用的方法；單克隆抗體的理化性狀高度均一,生物活性單一,與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng),便于人為處理和質(zhì)量控制,來源容易等特點(diǎn),使它的應(yīng)用一直廣泛地受到關(guān)注。血清中apoM蛋白分子量小,與脂蛋白結(jié)合緊密,物理方法不易分離,我們?cè)谇捌谘芯恐兄苽淞烁呒兌鹊闹亟MTrx-apoM蛋白,為單克隆抗體的制備提供了基礎(chǔ)。 目的： 制備親和力高、純度好的apoM單克隆抗體,并對(duì)抗體的濃度、免疫球蛋白亞類、相對(duì)親和力和特異性進(jìn)行分析鑒定。 方法： 用重組Trx-apoM蛋白免疫Ba1b/c小鼠,經(jīng)細(xì)胞融合、篩選及克隆化,得到三株生長(zhǎng)良好,分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株；腹腔注射于Balb/c小鼠,收取腹水,純化后得到三個(gè)抗apoM單克隆抗體。純化后的抗體經(jīng)12%SDS-PAGE電泳觀察純化效果；用抗體亞類測(cè)定試劑盒檢測(cè)單抗免疫球蛋白亞類；通過直接法ELISA相加試驗(yàn)判斷三株單克隆抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)；用直接ELISA法測(cè)定三株亞克隆抗體的相對(duì)親和力；用間接法ELISA阻斷試驗(yàn)判斷單克隆抗體的特異性；用免疫熒光和免疫組織化學(xué)的方法判斷單克隆抗體與細(xì)胞和組織的反應(yīng)特性；用Westren印跡法比較單克隆抗體與重組Trx-apoM蛋白、人血漿蛋白的反應(yīng)。 結(jié)果： 1、得到了三株分泌穩(wěn)定、生長(zhǎng)良好的亞克隆雜交瘤細(xì)胞株。用該三株雜交瘤細(xì)胞接種小鼠得到的腹水單抗效價(jià)達(dá)到了1：106-1：107。 2、經(jīng)亞型鑒定結(jié)果顯示三株mAb均為IgG2aκ。 3、1E2F12和8F12C6兩株單抗識(shí)別抗原的位點(diǎn)不同,1E2F12特異性結(jié)合的抗原位點(diǎn)也不同于14H1B7；同時(shí)結(jié)合抗原的能力1E2F12/8F12C6強(qiáng)于1E2F12/14H1B7。 4、三株單克隆抗體親和力由大到小次為1E2F128F12C614H1B7。 5、阻斷試驗(yàn)顯示三株抗體均具有較好的特異性。 6、Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組Trx-apoM蛋白與單克隆抗體的反應(yīng)情況,在約34kD處三株單抗均有特異性條帶,與預(yù)測(cè)的分子大小位置符合,背景清楚。 7、與正常人肝細(xì)胞裂解液和混合人血清的Western印跡實(shí)驗(yàn)中,在分子量24kD處有特異性條帶出現(xiàn)。 8、用制備的單抗檢測(cè)apoM在不同種屬細(xì)胞中的表達(dá),表明在人正常肝細(xì)胞、猴腎細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)。 9、用三株單克隆抗體檢測(cè)人組織中apoM蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)在人肝組織細(xì)胞漿及人胰腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞漿、膜中呈陽(yáng)性表達(dá),在心、肺、脾、大腸和小腸組織中未檢測(cè)到該蛋白的表達(dá),符合率達(dá)100%。 結(jié)論： 成功制備了三株抗apoM的單克隆抗體,不僅能與重組蛋白反應(yīng),還可與人體內(nèi)的天然蛋白結(jié)合,是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道制備出了針對(duì)人血清天然apoM蛋白的鼠抗人單克隆抗體,為下一步定量檢測(cè)人血清中apoM蛋白含量打下了基礎(chǔ)。 第三部分EL ISA法測(cè)定血清中載脂蛋白M濃度的方法學(xué)評(píng)價(jià)及其與血脂相關(guān)性分析 研究背景： apoM主要存在于HDL中,在肝臟和腎臟中表達(dá),提示該蛋白與血脂的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)。最近Xu等發(fā)現(xiàn)血液中apoM濃度與體重指數(shù)(BMI)以及血液中瘦素(Leptin)含量呈正相關(guān),而與血液中總膽固醇呈負(fù)相關(guān),但相關(guān)機(jī)制還未明確。另外,apoM屬于Lipocalin超家族,推測(cè)可能與血漿中疏水性生物活性分子的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)聯(lián),其確切功能尚有待進(jìn)一步研究。目前國(guó)內(nèi)定量檢測(cè)apoM濃度的方法僅限于半定量的Western印跡和Dot-Blotting法,需要建立標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、方法穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單的定量檢測(cè)方法,這對(duì)于臨床研究的深入進(jìn)行將有極大的幫助。 目的： 建立測(cè)定人血漿中apoM濃度的雙抗體夾心法,并對(duì)該方法的敏感性、重復(fù)性、抗干擾能力等作一評(píng)價(jià)；并建立該方法的正常人參考范圍；觀察血漿中apoM與血脂之間的相關(guān)關(guān)系；初步比較正常人與冠心病各組人群之間血漿apoM濃度的變化趨勢(shì)。 方法： 用棋盤滴定法選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度；用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗apoM 8F12C6抗體；用蛋白稀釋度曲線確定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍；用血漿稀釋度曲線確定實(shí)驗(yàn)中人血漿的稀釋倍數(shù)；確定了該方法的最低檢測(cè)限,測(cè)定批間、內(nèi)變異及非特異性脂蛋白的干擾,以觀察方法的敏感性和特異性。通過測(cè)定124例健康體檢人群血漿apoM的濃度,建立本實(shí)驗(yàn)室的正常參考值范圍。比較穩(wěn)定型心絞痛組(SA)32例和急性冠脈綜合征組(ACS)34例病人與35例健康人群的血漿蛋白濃度,分析apoM在不同人群中的變化趨勢(shì)。 結(jié)果： 1、根據(jù)重組蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,該方法的線性范圍為31.25-375ng/ml,最低檢測(cè)限為11.8 ng/ml。批內(nèi)變異4.32-5.69%；批間變異5.24-5.83%。 2、血漿滴度曲線結(jié)果表明,人血漿在1：50到1：400范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,取線性范圍中間整數(shù)倍1：200稀釋度,,作為實(shí)驗(yàn)中人血漿apoM濃度檢測(cè)的最佳稀釋倍數(shù)。 3、不同濃度的脂蛋白apoAI、apoB及Lp(a)對(duì)該法干擾小,其測(cè)定的吸光度值均低于0.33,在該方法的線性范圍外。 4、該方法的正常參考值范圍為13.15±2.68μg/ml。 5、apoM與TG、TC及LDL-C呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì),但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與HDL-C、HDL-C/TC呈正相關(guān)(r=0.336和r=0.345)。 6、兩組冠心病患者血漿apoM濃度(SA組11.02±1.96μg/ml, ACS組10.76±1.32μg/ml)均低于正常對(duì)照組(12.83±2.28μg/ml),但兩組冠心病組之間濃度差異不明顯。 結(jié)論： 我們建立了測(cè)定人血漿中apoM的濃度的雙抗體夾心法,通過檢測(cè)該方法的敏感性、重復(fù)性、抗干擾能力等指標(biāo),認(rèn)為該方法穩(wěn)定性、敏感性和特異性均好,與國(guó)內(nèi)外檢測(cè)apoM濃度的方法相比,我們建立的ELISA法具有操作簡(jiǎn)單,標(biāo)準(zhǔn)蛋白來源恒定,易于大批檢測(cè)和適應(yīng)臨床檢測(cè)的特點(diǎn),為apoM在臨床研究中的廣泛開展提供了方便、可靠的工具。
[Abstract]:The expression and purification of human apolipoprotein M in part 1
Research background:
Apolipoprotein M (apolipoprotein M apoM) is a newly discovered apolipoprotein, belonging to the hydrophobic binding protein family, mainly in HDL. Animal and cell experiments show that apoM by participating in the formation of beta -HDL, in promoting reverse cholesterol transport process, but also anti-inflammatory and antioxidant effect. Therefore, think that apoM has anti atherosclerosis effect, but its anti atherosclerosis mechanism is still unclear. Because apoM is apolipoprotein a small molecule, the molecular weight of only 24kD, and hydrophobic signal peptide mediated maturation of molecules in the guide of the protein anchored to phospholipid monolayer on the direct extraction of apoM from serum protein is difficult. This study by means of genetic engineering, the expression of recombinant apoM protein in vitro, and preparation of anti apoM monoclonal antibody, lay the foundation for research on the structure and function of apoM protein.
Objective:
The recombinant human full-length apoM protein was expressed and purified, and the recombinant apoM protein with high concentration and good purity was obtained.
Method錛，

本文編號(hào)：1399959