本文關(guān)鍵詞：活性氧和p53在低濃度亞砷酸鈉拮抗DNA雙鏈斷裂損傷中的作用　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：砷(As)是自然界中廣泛存在,并具有類金屬特性的元素。亞砷酸鈉(NaAsO2)是砷元素在環(huán)境中存在的主要形式并且其分布十分廣泛。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),砷化物的暴露可以引起肺,皮膚,肝,腎,膀胱腫瘤。同時(shí),砷化物也被用作治療白血病等癌癥的藥物。但是,對(duì)其致癌及抗癌機(jī)制目前仍然不清楚。 不同濃度NaAsO_2引起不同水平的活性氧(ROS)升高,兩者之間存在較好的正相關(guān)關(guān)系。ROS除了是一種破壞性強(qiáng)大的毒性物質(zhì)即引起機(jī)體生物大分子氧化性損傷,造成細(xì)胞變性、壞死以外,適量的ROS還是對(duì)細(xì)胞具有廣泛調(diào)節(jié)功能,參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、激活轉(zhuǎn)錄因子,影響基因表達(dá),從而使細(xì)胞產(chǎn)生自我保護(hù)作用的調(diào)節(jié)分子。p53被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激的關(guān)鍵性調(diào)控分子之一,在細(xì)胞內(nèi)扮演重要的監(jiān)控角色,能夠整合細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外各種應(yīng)激信號(hào)并對(duì)此產(chǎn)生反應(yīng)。已研究發(fā)現(xiàn)p53可以直接與某些DNA損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白相互作用或作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)修復(fù)過程中的某些蛋白表達(dá),從而提高細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力。 本研究選用人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)和人角質(zhì)化細(xì)胞(HaCaT)作為細(xì)胞模型,探討低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2對(duì)兩種細(xì)胞ROS水平、DSBs損傷、細(xì)胞凋亡和p53表達(dá)的影響及其相互關(guān)系;并在觀察不同濃度MMS所致DSBs損傷基礎(chǔ)上,探討低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2對(duì)MMS所致兩種細(xì)胞DSBs損傷的影響;然后應(yīng)用ROS拮抗劑過氧化氫酶和p53特異抑制劑Wortmannin預(yù)處理后再觀察低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2所致ROS水平和對(duì)MMS所致DSBs損傷的影響,從而探討ROS和p53在低濃度NaAsO_2拮抗MMS所致細(xì)胞DSBs損傷中的作用,為深入研究砷化物對(duì)機(jī)體和組織細(xì)胞影響及其分子機(jī)制研究提供科學(xué)線索。 方法 一、低濃度NaAsO_2對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞ROS水平的影響 用0、0.1和0.5μM NaAsO_2處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h,根據(jù)DCFH-DA方法用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定ROS熒光強(qiáng)度,以檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。 二、低濃度NaAsO_2對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞凋亡和DSBs損傷的影響 用0、0.1和0.5μM NaAsO_2處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h,用Hoechest33258對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài),細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染者為凋亡細(xì)胞,計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡率。用Western blot方法檢檢測(cè)細(xì)胞凋亡指標(biāo)斷裂caspase -3表達(dá)和DSBs損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)。 三、不同濃度MMS所致HELF和HaCaT細(xì)胞DSBs損傷 用0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mM MMS分別處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h后,用Western blot法檢測(cè)HELF和HaCaT細(xì)胞特異性DSBs損傷蛋白γ-H2AX表達(dá)。 四、低濃度NaAsO_2對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞p53表達(dá)的影響及其與ROS關(guān)系 分別用0、0.1和0.5μM NaAsO_2分別處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h后,用免疫熒光和Western blot兩種方法分別檢測(cè)p53表達(dá)情況。并應(yīng)用0.1μM NaAsO_2和細(xì)胞內(nèi)ROS拮抗劑過氧化氫酶聯(lián)合處理HELF和HaCaT細(xì)胞后,用Western blot方法檢測(cè)p53表達(dá),以探討低濃度NaAsO_2對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞p53表達(dá)的影響及其與ROS關(guān)系。 五、低濃度NaAsO_2對(duì)MMS所致HELF和HaCaT細(xì)胞DSBs損傷和p53表達(dá)的影響 用0.1和0.5μM NaAsO_2預(yù)處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h后,再用0.6 mM MMS處理細(xì)胞6 h,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞p53表達(dá)和DSBs損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)。 六、p53抑制在低濃度NaAsO_2拮抗MMS所致DSBs損傷中的作用 HELF和HaCaT細(xì)胞分別先用10μM Wortmannin或/和0.1μM NaAsO2預(yù)處理6 h后,再用0.6 mM MMS處理6 h,Western blot檢測(cè)HELF和HaCaT細(xì)胞p53表達(dá)和DSBs損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)。 結(jié)果 一、低濃度NaAsO_2對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞ROS水平的影響 低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2處理HELF和HaCaT細(xì)胞均引起ROS熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組(p0.05),說明低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2可以引起細(xì)胞ROS水平一定程度升高。 二、低濃度NaAsO_2對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞凋亡和DSBs損傷的影響 用0、0.1和0.5μM NaAsO_2分別處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h后,用Hoechst33258染色檢測(cè)HELF和HaCaT細(xì)胞凋亡率,用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白斷裂caspase-3和DSB損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)。結(jié)果顯示,低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2處理組與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率無顯著性差別(p0.05),且低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2處理組也未檢測(cè)到斷裂caspase-3表達(dá)和γ-H2AX表達(dá),從而說明低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2未引起HELF和HaCaT細(xì)胞DSBs損傷和細(xì)胞凋亡。 三、不同濃度MMS對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞DSBs損傷的影響 用0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mM MMS分別處理HELF和HaCaT 細(xì)胞6 h后,用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞DSBs損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)情況。結(jié)果顯示,MMS引起了明顯的γ-H2AX表達(dá)升高,并呈濃度-效應(yīng)關(guān)系,從而說明,不同濃度MMS可明顯引起DSBs損傷。 四、低濃度NaAsO對(duì)HELF和HaCaT細(xì)胞p53表達(dá)的影響及其與ROS關(guān)系 低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2明顯誘導(dǎo)p53表達(dá)升高;而0.1μM NaAsO_2和細(xì)胞內(nèi)ROS拮抗劑過氧化氫酶預(yù)處理HELF和HaCaT細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)0.1μM NaAsO_2可明顯提高p53表達(dá),而這種p53表達(dá)升高可以被過氧化氫酶所拮抗。從而說明低濃度NaAsO_2刺激HELF和HaCaT細(xì)胞p53表達(dá)升高是通過ROS實(shí)現(xiàn)的。 五、低濃度NaAsO_2對(duì)MMS所致DSBs損傷和p53表達(dá)的影響 用0.1和0.5μM NaAsO_2預(yù)處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h后,再用0.6 mM MMS處理6 h,用免疫熒光和Western blot法檢測(cè)p53表達(dá)和DSBs損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)。免疫熒光和Western blot結(jié)果均顯示,低濃度0.1和0.5μM NaAsO_2預(yù)處理組γ-H2AX表達(dá)明顯低于MMS單獨(dú)處理組;而p53表達(dá)在0.1μM NaAsO_2和MMS聯(lián)合處理組表達(dá)明顯高于其它組。從而說明低濃度NaAsO_2可明顯拮抗MMS所致DSBs損傷,而且p53可能在其中發(fā)揮重要作用。 六、p53抑制劑Wortmannin和低濃度NaAsO_2對(duì)MMS所致DSBs損傷的影響 用10μM Wortmannin或/和0.1μM NaAsO_2預(yù)處理HELF和HaCaT細(xì)胞6 h后,再用0.6 mM MMS 6 h。Western blot結(jié)果顯示,在兩種細(xì)胞中Wortmannin預(yù)處理組p53表達(dá)最低,而0.1μM NaAsO2和MMS聯(lián)合處理組p53表達(dá)最高;在兩種細(xì)胞中Wortmannin預(yù)處理組DSBs損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)最高,而0.1μMNaAsO2和MMS聯(lián)合處理組DSBs損傷指標(biāo)γ-H2AX表達(dá)最低。從而說明p53被抑制可阻止低濃度NaAsO2拮抗MMS所致DSBs損傷效應(yīng),進(jìn)一步證明p53在低濃度NaAsO2拮抗MMS所致DSBs損傷作用中發(fā)揮重要作用。 結(jié)論 1、低濃度NaAsO2可以誘導(dǎo)HELF和HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生一定水平的ROS,但未引起DsBs損傷和細(xì)胞凋亡。 2、低濃度NaAsO2通過ROS引起HELF和HaCaT細(xì)胞p53表達(dá)明顯升高。 3、低濃度NaAsO2可以拮抗MMS所致DSBs損傷。 4、ROS和p53在低濃度NaAsO2拮抗MMS所致DSBs損傷中發(fā)揮了重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 束長(zhǎng)亮;汪e，

本文編號(hào)：1394786