本文關(guān)鍵詞：肺炎嗜衣原體CPAF重組蛋白致小鼠肺組織炎癥及對炎癥細(xì)胞因子影響的研究　出處：《南華大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的:將本室構(gòu)建的肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease like activity factor,CPAF)的181～400aa基因(CPAFm)的重組表達(dá)體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行鑒定,研究該重組蛋白在BALB/c小鼠體內(nèi)引起的肺部炎癥改變及對炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平的影響,為進(jìn)一步探索CPAF在Cpn感染中的致病作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:重組質(zhì)粒pGEX6p-2/CPAFm,經(jīng)酶切和測序鑒定后,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),采用SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物;復(fù)性后用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)瓊脂糖凝膠FF純化重組蛋白,A280紫外分光光度法測定純化蛋白濃度。將純化的重組蛋白第1d、3d、6d鼻內(nèi)或尾靜脈注射BALB/c小鼠,第7d處死小鼠,HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變,常規(guī)血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)外周血與支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)中白細(xì)胞總數(shù),瑞氏染色觀察外周血與BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù), ELISA方法檢測血漿和BALF中的TNF-α和IL-6的水平。 結(jié)果:重組目的基因表達(dá)菌在IPTG的誘導(dǎo)下,表達(dá)了相對分子質(zhì)量(Mr)約51.3 kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在,經(jīng)GST瓊脂糖凝膠FF純化得到純度達(dá)95%以上的重組蛋白。重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠肺組織的炎癥病理損傷,光鏡下見BALB/c小鼠的肺組織出現(xiàn)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤,對照組與正常組BALB/c小鼠肺組織未見明顯病理改變。尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)組的BALB/c小鼠外周血中性粒細(xì)胞比例明顯高于GST、PBS對照組和正常組(均P㩳0.01),單核細(xì)胞比例明顯高于GST對照組(P㩳0.05)、PBS對照組(P㩳0.05)和正常組(P㩳0.01);鼻內(nèi)滴入實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)明顯高于GST對照組(P㩳0.05)、PBS對照組(P㩳0.05)和正常組(P㩳0.01);鼻內(nèi)滴入實(shí)驗(yàn)組外周血中炎癥因子IL-6水平顯著高于GST、PBS對照組和正常組(均P㩳0.01),TNF-α水平明顯高于GST對照組(P㩳0.05)、PBS對照組(P㩳0.01)和正常組(P㩳0.01);尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)組外周血中炎癥因子IL-6的水平明顯高于GST、PBS對照組與正常組(均P㩳0.01);鼻內(nèi)滴入和尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)組BALF中炎癥因子IL-6、TNF-α的水平明顯高于GST、PBS對照組與正常組(均P㩳0.01)。 結(jié)論: 1、成功表達(dá)純化得到51.3 kDa的GST-CPAFm重組蛋白和26kDa的GST蛋白; 2、GST-CPAFm重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠肺組織的炎癥病理損傷; 3、GST-CPAFm重組蛋白能引起B(yǎng)ALB/c小鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞增多和炎癥因子TNF-α、IL-6的水平的升高。
[Abstract]:Objective: to construct Chlamydophila pneumoniae of Chlamydophila pneumoniae. CPN) protease-like activity factor Chlamydial protease like activity factor. The recombinant expression of CPAF-181h400AA gene was induced and expressed in Escherichia coli, the expressed product was purified and identified. Objective: to study the changes of pulmonary inflammation induced by the recombinant protein in BALB/c mice and its effect on the levels of inflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-6. To provide experimental basis for further exploring the pathogenicity of CPAF in Cpn infection. Methods: the recombinant plasmid pGEX6p-2 / CPAFm was digested and sequenced, then transformed into E. coli BL21. The expressed products were analyzed and identified by SDS-PAGE and Western blot. The recombinant protein was purified by glutathione S-transferase (GST) agarose gel FF after renaturation. A280 UV spectrophotometry was used to determine the concentration of purified protein. The purified recombinant protein was injected intranasal or caudal intranasal or caudal vein for 6 days on the 1st day, and the mice were killed on the 7th day. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining. The peripheral blood and bronchoalveolar lavage fluids were measured by routine blood cell count method. The total number of white blood cells in BALF, the number of leukocytes in peripheral blood and BALF were observed by Rayleigh staining, and the levels of TNF- 偽 and IL-6 in plasma and BALF were detected by ELISA method. Results: the recombinant target gene expression strain induced by IPTG expressed a target protein of about 51. 3 kDa. Objective protein mainly exists in the form of inclusion body in the cell. Purified by GST agarose gel FF, a recombinant protein with purity of more than 95% was obtained. The recombinant protein can induce inflammatory pathological damage in lung tissue of BALB/c mice. Under the light microscope, the lung tissue of BALB/c mice showed neutrophils, mononuclear macrophages, lymphocytes and other inflammatory cells infiltration. There were no obvious pathological changes in lung tissue of BALB/c mice in control group and normal group. The percentage of neutrophils in peripheral blood of BALB/c mice injected with caudal vein was significantly higher than that of GST. PBS control group and normal group (all P? The percentage of monocytes was significantly higher than that of GST control group. PBS control group (P < 0.05). 0. 05) and normal group P? The total number of leukocytes in BALF of experimental group BALB/c mice was significantly higher than that of GST control group. PBS control group (P < 0.05). 0. 05) and normal group P? The level of inflammatory factor IL-6 in peripheral blood of the experimental group was significantly higher than that of the control group and the normal group. The level of TNF- 偽 in GST group was significantly higher than that in control group. PBS control group (P < 0.05). 0. 01) and normal group P? The level of inflammatory factor IL-6 in peripheral blood of the caudal vein injection group was significantly higher than that of the control group and the normal group. The level of IL-6 TNF- 偽 in BALF of the experimental group was significantly higher than that of the control group and the normal group (P < 0.01), and the level of IL-6 TNF- 偽 in the experimental group was significantly higher than that in the control group and the normal group (P < 0.01). 0.01g. Conclusion: 1. 51.3 kDa GST-CPAFm recombinant protein and 26kDa GST protein were successfully expressed and purified. 2GST-CPAFm recombinant protein can induce inflammatory pathological injury in lung tissue of BALB/c mice. 3GST-CPAFm recombinant protein could induce the increase of inflammatory cells and the level of TNF- 偽 IL-6 in BALB/c mice.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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