本文關(guān)鍵詞：雞CARP單克隆抗體制備及其在骨骼肌發(fā)育中的表達(dá)　出處：《黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 心肌錨定重復(fù)蛋白 原核表達(dá) 雜交瘤 單克隆抗體

【摘要】： 心肌錨定重復(fù)蛋白(CARP)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,是錨定重復(fù)序列家族成員之一,具有錨定重復(fù)區(qū)、兩個PEST基序以及一個核定位信號。目前CARP已經(jīng)被確定為一個新的心血管疾病的分子標(biāo)志物,它在胚胎期、新生期和成年哺乳動物心臟中高水平表達(dá)。CARP具有多種功能,在血管發(fā)生,心臟發(fā)育,細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)錄調(diào)控,纖維的裝配和拉伸傳感,核質(zhì)通訊等方面具有重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)與哺乳動物相比,CARP在雞骨骼肌組織中呈特異性表達(dá),這暗示了CARP可能在雞骨骼肌發(fā)育過程起重要作用,因此深入研究CARP在雞骨骼肌發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。為了研究CARP在雞骨骼肌發(fā)育過程中的表達(dá),本試驗(yàn)克隆表達(dá)并純化了雞CARP重組蛋白,并制備了抗雞CARP單克隆抗體,在蛋白質(zhì)水平來檢測其在骨骼肌發(fā)育過程中的表達(dá)。 利用RT-PCR的方法從雞骨骼肌擴(kuò)增獲得CARP N端110個氨基酸的cDNA,將其克隆至原核表達(dá)載體pET28b中,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,并測序驗(yàn)證。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明與未誘導(dǎo)菌株相比,誘導(dǎo)后的重組菌表達(dá)分子量約18000的重組蛋白,并主要以可溶性形式存在,該蛋白經(jīng)灰度分析純度能達(dá)到88.5%。 用純化的CARP重組蛋白免疫8周齡BALB/c小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,間接ELISA法進(jìn)行篩選陽性克隆,經(jīng)多次克隆化培養(yǎng),篩選高分泌滴度的陽性雜交瘤細(xì)胞株,制備腹水并純化。采用McAb亞類鑒定試劑盒確定單克隆抗體亞型,對篩選得到的雜交瘤細(xì)胞染色體分析,檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水效價(jià),并用Western blot方法對McAbs進(jìn)行特異性鑒定。為研究CARP在肌肉不同發(fā)育時期的表達(dá),本實(shí)驗(yàn)選取胚胎期,出生后幼雛,成年雞為研究對象,從雞肌骨骼肌提取總蛋白,采用Western blot檢測肌肉發(fā)育過程中CARP在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。 結(jié)果最終獲得兩株能穩(wěn)定分泌抗雞CARP雜交瘤細(xì)胞株,分命名為4A8、4E62,亞型都屬于IgG1,輕鏈為κ鏈;融合細(xì)胞的染色體數(shù)目均大于89條,符合雜交瘤染色體數(shù)目。兩株雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠的腹水及其細(xì)胞培養(yǎng)液上清的效價(jià)分別為3.2×104、1.28×105和2.56×103、2.56×103。Western blot結(jié)果表明McAb能識別重組表達(dá)和內(nèi)源性的CARP蛋白,并且與小鼠CARP蛋白無交叉反應(yīng)。在蛋白質(zhì)水平,CARP僅在出殼后的雞骨骼肌中表達(dá)。 本研究成功獲得2株能識別雞CARP的雜交瘤及其分泌的特異性McAbs,為進(jìn)一步研究CARP的功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ);試驗(yàn)結(jié)果表明其CARP可能在雞骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Cardiac Anchorage repeat protein (CARP) is an important nuclear transcription regulator and a member of the family of anchoring repeats with anchoring repeats. Two PEST motifs and a nuclear locus signal. CARP has been identified as a new molecular marker of cardiovascular disease at embryonic stage. High level expression of .CARP in newborn and adult mammalian hearts has many functions, such as angiogenesis, cardiac development, apoptosis, transcriptional regulation, fiber assembly and stretch sensing. Nuclear and cytoplasmic communication plays an important role. Recently, it has been found that Carp is specifically expressed in chicken skeletal muscle compared with mammalian. This suggests that CARP may play an important role in the development of chicken skeletal muscle. Therefore, it is of great significance to study the regulatory mechanism of CARP in chicken skeletal muscle. In order to study the expression of CARP during the development of chicken skeletal muscle. The recombinant chicken CARP protein was cloned and purified, and monoclonal antibody against chicken CARP was prepared to detect its expression in skeletal muscle development at protein level. CARP N-terminal 110 amino acid cDNA was amplified from chicken skeletal muscle by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET28b. Then it was transformed into E. coli BL21 and DE3, and the plasmid was digested and identified by double enzyme digestion. The recombinant strain was induced by IPTG and purified by SDS-PAGE. After induction, the recombinant protein with molecular weight of about 18000 was expressed and mainly existed in soluble form. The purity of the protein reached 88.5 by gray level analysis. The purified CARP recombinant protein was used to immunize 8-week-old BALB/c mice. The spleen cells were fused with SP2/0 myeloma cells and the positive clones were screened by indirect ELISA method. The positive hybridoma cell lines with high secretory titers were screened after multiple cloning, ascites were prepared and purified. Monoclonal antibody subtypes were determined by McAb subclass identification kit. Chromosome analysis of the selected hybridoma cells was performed to detect the titer of cell culture supernatant and ascites. In order to study the expression of CARP in different stages of muscle development, the embryonic and postnatal chicks were selected to identify the specificity of McAbs by Western blot. The total protein was extracted from the skeletal muscle of the adult chicken and the expression of CARP in the muscle development was detected by Western blot. Results two hybridoma cell lines with stable secretion of chicken CARP were obtained, named as 4A8, 4E62.The subtypes belonged to IgG1 and the light chain was 魏 chain. The chromosome number of the fusion cells was more than 89, which was consistent with the number of hybridoma chromosomes. The titers of ascites and supernatants of the two hybridoma cells immunized mice were 3.2 脳 104, respectively. The results of 1.28 脳 10 ~ 5 and 2.56 脳 10 ~ (3) Western blot showed that McAb could recognize recombinant and endogenous CARP proteins. There was no cross reaction with mouse CARP protein and the protein level was only expressed in chicken skeletal muscle after exfoliation. In this study, two strains of hybridoma recognized chicken CARP and specific McAbs secreted were successfully obtained, which laid a material foundation for further study on the function of CARP. The results suggest that CARP may play an important role in the development of chicken skeletal muscle.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392.11

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)會議論文 前5條

1 康相濤;;雞肌細(xì)胞生成素基因第一外顯子的多態(tài)性與肌纖維特性的相關(guān)分析[A];河南省畜牧獸醫(yī)學(xué)會第七屆理事會第二次會議暨2008年學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

2 王立新;白俊杰;陳宏;羅建仁;葉星;簡清;勞海華;;斑馬魚MyoD基因部分序列的克隆與分析[A];全國首屆動物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

3 陳玉紅;陳雪梅;鐘金城;陳智華;胡漢傈;張亞美;馬志杰;常懷普;;不同牛種Myf-5基因部分片段的克隆測序分析[A];第十次全國畜禽遺傳標(biāo)記研討會論文集[C];2006年

4 秦召;康相濤;孫桂榮;陳其新;田亞東;韓瑞麗;黃艷群;李國喜;;雞肌細(xì)胞生成素基因內(nèi)含子Ⅱ的克隆及序列分析[A];中國家禽業(yè)——機(jī)遇與挑戰(zhàn)——第十三次全國家禽學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2007年

5 趙金紅;黃勇富;高雪;許尚忠;彭祥偉;王高富;蔣安;高立芳;;牛肌分化因子MyoD的新等位基因的發(fā)現(xiàn)[A];第四屆中國畜牧科技論壇論文集[C];2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王覺進(jìn);促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子2型受體在腫瘤生長中的作用及其機(jī)制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

2 陳付英;MEF2A基因原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及黃牛MEF2A、DLK1和CLPG基因遺傳分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

3 朱素華;蒽環(huán)類抗癌藥物及其與DNA相互作用的分子模擬研究[D];上海大學(xué);2011年

4 彭澍;曲美他嗪對慢性心力衰竭療效的系統(tǒng)評價(jià)[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

5 朱礪;豬骨骼肌形成過程中的幾種決定因子（MDF）的遺傳效應(yīng)及其遺傳多態(tài)性和分子進(jìn)化研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

6 吳瀅;表皮生長因子對腎小球上皮影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

7 王恒;肌肉中calsarcin基因的差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

8 帥怡;金屬硫蛋白抗阿霉素心臟毒性作用的基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];四川大學(xué);2007年

9 虞德兵;豬IGF-Ⅱ基因變異對豬生長性狀及肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 歐柏青;趨化因子Fractalkine及其受體在動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用及氟伐他汀/普羅布考的干預(yù)研究[D];中南大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 謝進(jìn);抗鵝膏肽的全合成及其活性測定[D];中南林業(yè)科技大學(xué);2009年

2 薛沖;日糧氨基酸模型對不同品種鵝MSTN基因表達(dá)的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 任寧;丙丁酚改善缺血性心肌病心力衰竭患者心功能及機(jī)制研究[D];南華大學(xué);2011年

4 趙強(qiáng);雞CFL2基因遺傳變異及其效應(yīng)與表達(dá)的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 何海燕;中藥創(chuàng)愈膏治療開放性軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)藥理研究[D];河北師范大學(xué);2002年

6 卡扎里;普羅布考對新西蘭白兔缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2003年

7 李景芬;七個豬種MyoD基因家族中三個基因外顯子的SNPs分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

8 蔡偉強(qiáng);Tx-TnT在洪山雞和艾維茵肉雞的肌肉組織中的蛋白表達(dá)差異研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

9 孫勝濤;β-胡蘿卜素對阿霉素致大鼠心肌組織的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶mRNA表達(dá)改變的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2005年

10 田璐;MyoD和DGAT1基因?qū)εｋ伢w性狀影響的分析[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

，

本文編號：1370409