發(fā)布時(shí)間：2017-12-30 08:01

  本文關(guān)鍵詞：基于EHECO157:H7志賀毒素ⅡB細(xì)胞表位肽的中和性MAb制備與生物學(xué)鑒定　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 腸出血性大腸桿菌(EHEC) O157:H7為重要的新發(fā)人畜共患傳染病原,1982年被確認(rèn)為致病菌以來的20多年中,其引發(fā)的食物中毒在世界各地包括中國(guó)均有大規(guī)模的暴發(fā)流行。該菌的感染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題,無論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家,都受到廣泛關(guān)注。由于EHEC O157:H7菌培養(yǎng)容易、感染力強(qiáng)、傳播途徑多樣,因此,O157菌極有可能當(dāng)作為未來戰(zhàn)爭(zhēng)軍事斗爭(zhēng)的細(xì)菌武器和生物恐怖的戰(zhàn)劑。然而目前對(duì)其感染尚缺乏有效的防治方法。研究證明:抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Shiga toxin, Stx),從而使患者并發(fā)HUS的危險(xiǎn)性增加。 研究表明:Stx2是O157:H7的主要致病因子。Stx可以進(jìn)入血液循環(huán),引起靶組織器官損傷,導(dǎo)致溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。Stx分為Stx1和Stx2,用純化的Stx1和Stx2處理人腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞,結(jié)果顯示:Stx2比Stx1的毒性大1000倍。Stx2是引起兒童和老年人發(fā)生HUS的主要毒素,造成該人群的死亡率高達(dá)50%。因此,Stx2是目前O157:H7感染治療藥物研究的主要靶標(biāo)。 Stx2蛋白質(zhì)由1個(gè)A亞基(32KDa)和5個(gè)B亞基(7.7KDa/單體)組成。A亞單位包括A1和A2兩個(gè)片段。A1片段為毒性活性片段,A2片段插入5個(gè)B亞基形成的孔中,B亞基為Stx2與細(xì)胞受體結(jié)合部位。Stx2通過B亞基與受體Gb3結(jié)合后,進(jìn)入細(xì)胞,在弗林蛋白酶(一種鈣敏感的絲氨酸蛋白酶)作用下A亞基被裂解為A1和A2兩個(gè)片段,A1片斷經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)暴露毒性活性位點(diǎn) A1片段發(fā)揮N-糖苷酶活性,導(dǎo)致真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的終止,最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。 鑒于Stx2的結(jié)構(gòu)和致病機(jī)理,針對(duì)Stx2的藥物研究主要集中在三個(gè)方面:STX2中和性抗體、Stx2疫苗Stx2特異受體Gb3的類事物,相比之下,Stx2中和性抗體在O157:H7感染的緊急治療中更顯優(yōu)勢(shì)。 因此,基于以上認(rèn)識(shí),本課題將以EHEC O157:H7 Stx2的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),輔以DNAStar軟件分析,預(yù)測(cè)并篩選靶向Stx2 A1片段毒性活性中心的保護(hù)性B細(xì)胞表位肽,利用此肽制備靶向Stx2毒性活性中心的中和性單克隆抗體,在此基礎(chǔ)上制備Fab基因工程抗體,以期獲得具有臨床治療價(jià)值的中和性抗體。本研究主要分四個(gè)部分: 第一部分基于EHEC O157:H7 Stx2晶體結(jié)構(gòu)的B細(xì)胞表位肽的預(yù)測(cè)與免疫原性鑒定 Stx2保護(hù)性B細(xì)胞表位肽的預(yù)測(cè)與鑒定是利用保護(hù)性B細(xì)胞表位肽為抗原靶向性制備Stx2中和性抗體的第一步。本部分研究是首先在NCBI的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫檢索EHEC O157:H7的Stx2以及Stx2與配體腺嘌呤復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析圖(編號(hào)1R4P和2GA4)�；赟tx2與配體腺嘌呤相互作用的立體結(jié)構(gòu),依據(jù)B表位肽的預(yù)測(cè)原則,選取Stx2 A1毒性片段上的4條氨基酸肽段,采用DNAStar軟件對(duì)預(yù)測(cè)的4條氨基酸肽段進(jìn)行親水性(Kyte-Doolittle方案)、表面可及性(Emini方案)、可塑性(Karp lus-Schulz方案)、二級(jí)結(jié)構(gòu)(Garnier和Chou-Fasman方案)及抗原性(Jameson-Wolf方案)等參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),通過BLAST檢索比較被預(yù)選B細(xì)胞表位肽與人、兔、鼠的同源性后,最終確定本研究所用的4條可能的B表位多肽序列,分別為P1(53aa~80aa)、P2(162aa~88aa)、P3(28aa~49aa)、P4(100aa~114aa);人工合成4條B表位肽(由北京中科亞光公司協(xié)助合成),并且均偶聯(lián)載體蛋白鑰孔戚血藍(lán)素(keyhole limpet hemocyanin KLH)后分別免疫日本大耳兔,鑒定其免疫原性,間接ELISA結(jié)果顯示:4條合成多肽均能刺激日本大耳兔產(chǎn)生抗多肽和天然Stx2的抗體,抗血清與天然Stx2反應(yīng)的效價(jià)P2P1P3P4;Dot ELISA結(jié)果顯示:4條B細(xì)胞表位肽制備的兔多克隆抗體能特異的與B細(xì)胞表位肽、Stx2和載體蛋白KLH反應(yīng);Western blot結(jié)果顯示:4條B細(xì)胞表位肽誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異針對(duì)Stx2 A亞單位的多克隆抗體,以上結(jié)果表明預(yù)測(cè)的4條多肽具有免疫原性,能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異的抗Stx2A亞單位的抗體,確為B細(xì)胞表位肽。用4條B細(xì)胞表位肽免疫Balb/c小鼠后,以天然Stx2攻毒,篩選出的P1(53aa~80aa)多肽為保護(hù)性B細(xì)胞表位肽,該表位肽包括Stx2毒性活性位點(diǎn)即位于Stx2 A1片段的第77位氨基酸-酪氨酸,為靶向Stx2毒素活性中心的中和性單克隆抗體的研制奠定了基礎(chǔ)。 第二部分基于EHEC O157:H7 Stx2 B細(xì)胞表位肽的中和性MAb制備與生物學(xué)鑒定 目前臨床上尚無特異的抗Stx2的治療性藥物,研究具有中和活性的單克隆抗體對(duì)EHEC O157:H7菌感染后的緊急治療具有意義。本部分研究是在第一部分成功獲得包含Stx2毒性活性中心的P1(53aa~80aa)保護(hù)性B細(xì)胞表位肽的基礎(chǔ)上,靶向性制備抗Stx2中和性單克隆抗體,并對(duì)單抗的生物學(xué)活性進(jìn)行了鑒定。首先,以偶聯(lián)載體蛋白KLH的P1保護(hù)性B細(xì)胞表位肽為免疫原,在應(yīng)用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ)上,采用含HAT的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基和以天然Stx2為篩選抗原的間接ELISA方法,快速篩選針對(duì)Stx2的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。結(jié)果從1700個(gè)單克隆雜交瘤細(xì)胞中篩選出7株穩(wěn)定分泌抗天然Stx2的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,染色體核型鑒定結(jié)果顯示:1F2、18C3、1G1和6B3 4株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目分別為106、100、98和104,接近小鼠脾細(xì)胞(2n=40)與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞(2n=62~68)染色體數(shù)目的總和,說明1F2、18C3、1G1和6B3 4株雜交瘤細(xì)胞為小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞的融合體。而9D7、8D4和11D3的染色體數(shù)目分別140、144和142,比小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目的總和約多40條,與2個(gè)脾細(xì)胞與1個(gè)SP2/0細(xì)胞的三倍體雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目相似;Dot-ELISA和Western Blot鑒定結(jié)果顯示:1F2、18C3、1G1、6B3 4株單抗為Stx2 A亞單位特異的單克隆抗體,而8D4、11D3、9D7 3株單抗與KLH有交叉反應(yīng),結(jié)合3株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為三倍體的結(jié)果,推測(cè)其原因可能是一個(gè)單克隆細(xì)胞株融合了針對(duì)Stx2和KLH兩種抗原決定簇的B淋巴細(xì)胞染色體;單克隆抗體的亞類鑒定結(jié)果顯示:1F2、3B6、1G1和18C3 4株天然Stx2特異的單克隆抗體均屬于IgG1κ型;1F2、3B6、1G1和18C3 4株單抗的抗體親和力常數(shù)鑒定結(jié)果分別為1.7×10-9、6.3×10-8、5.7×10-7和9×10-7。 體外細(xì)胞毒阻斷試驗(yàn)表明1F2、18C3、1G1和6B3 4株單克隆均有中和Stx2的作用,4株單抗中和作用相比:1F218C31G1=6B3;同時(shí)高劑量的單抗具有明顯的預(yù)防保護(hù)作用;體外單克隆抗體治療保護(hù)試驗(yàn)研究顯示:1F2和18C3的高劑量組有一定的治療保護(hù)作用,而且加入抗體越早中和作用越明顯,一旦毒素與細(xì)胞結(jié)合則抗體不能發(fā)揮保護(hù)作用,同時(shí)結(jié)果顯示1G1和6B3沒有明顯的治療保護(hù)作用,其原因可能與2株抗體的親和力較低有關(guān)。此外,P1B細(xì)胞表位肽體外競(jìng)爭(zhēng)抑制1F2單克隆抗體對(duì)Stx2毒性中和作用試驗(yàn)結(jié)果表明:P1B細(xì)胞表位肽與Stx2具有相同的毒性活性表位,因此本研究選用體外實(shí)驗(yàn)證明預(yù)防保護(hù)作用最強(qiáng)的1F2單抗作為動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)作用研究的對(duì)象。1F2單克隆抗體體內(nèi)預(yù)防保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:高劑量的1F2單克隆抗體組(3200ng/kg)的小鼠較存活率為80%(8/10),明顯比中、低劑量1F2單克隆抗體對(duì)Stx2的預(yù)防保護(hù)作用強(qiáng);1F2單克隆抗體體內(nèi)治療保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:高劑量的1F2單克隆抗體組的小鼠存活率達(dá)60%(6/10),具有明顯的治療效果,而中低劑量的1F2單克隆抗體對(duì)預(yù)先用Stx2攻毒的小鼠的治療效果較弱,為20%(2/10)~10% (1/10)。 本部分研究表明:制備的抗Stx2毒性活性中心的單克隆抗體1F2具有高特異性、高親和力,在動(dòng)物體內(nèi)能有效中和Stx2毒素,具有良好預(yù)防和治療作用。為臨床上使用抗Stx2的特異性抗體治療EHEC O157:H7感染,預(yù)防HUS和TTP等并發(fā)癥的出現(xiàn),提供了可能。本研究制備的抗Stx2毒性活性中心的單克隆抗體1F2可用于基因工程改造,制備各種形式的重組抗體。 第三部分EHEC O157:H7 Stx2中和性Fab抗體的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析 鼠源性單克隆抗體的異源性,限制了其在臨床治療中的應(yīng)用,本部分研究采用基因工程技術(shù)將1F2中和性單抗改造成Fab基因工程抗體。首先從分泌抗Stx2毒性活性中心的中和性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株1F2中提取總RNA,以提取的總RNA為模板,采用One step PT-PCR試劑盒,以根據(jù)鼠免疫球蛋白不同家族的可變區(qū)基因序列設(shè)計(jì)的7對(duì)κ輕鏈引物和8對(duì)IgG1重鏈Fd片段引物,分別擴(kuò)增1F2抗體的κ輕鏈和Fd片段基因,將釣取的抗體κ鏈和Fd鏈基因構(gòu)建至Fab抗體表達(dá)載體Pcomb3X,并切除Pcomb3X載體上的噬菌體外殼蛋白Ⅲ的基因后,轉(zhuǎn)化XL-Blue菌。 本部分研究成功構(gòu)建了1F2Fab抗體的表達(dá)載體,基因測(cè)序結(jié)果顯示:1F2Fab抗體的κ鏈為648bp,Fd1鏈為636bp,采用生物信息學(xué)方法對(duì)所得Fab抗體序列與現(xiàn)有已報(bào)道的其它各種抗體基因進(jìn)行同源性比較,分析其胚系基因來源,結(jié)果κ鏈基因序列與鼠抗體的κ鏈的胚系基因以及Fd鏈基因序列和鼠抗體重鏈的胚系基因具有較高的一致性,分別為92%和87%,且和現(xiàn)有報(bào)道的各種其它已知抗體基因序列均不完全一致。說明1F2Fab抗體的基因的確來自小鼠胚系基因。根據(jù)1F2Fab抗體基因序列,經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件推導(dǎo)出編碼1F2Fab抗體的Fd鏈編碼212個(gè)氨基酸,分子量為22436.31Da;1F2Fab抗體的κ編碼216個(gè)氨基酸,分子量為23882.52Da。將1F2Fab抗體的氨基酸序列提交SWISS-MODEL在線工具,經(jīng)分子模建對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)并提交PDB數(shù)據(jù)庫比對(duì),結(jié)果顯示:1F2Fab抗體的Fd鏈具有鼠Fab抗體重鏈結(jié)構(gòu)特征,可變區(qū)位于1~108位氨基酸;1F2Fab抗體的κ鏈具有鼠Fab抗體輕鏈結(jié)構(gòu)特征,可變區(qū)位于1~106位氨基酸。Fd鏈的CDR1、CDR2和CDR3的區(qū)域分別為20aa~27aa、45aa~52aa和91a~100aa;κ鏈的CDR1、CDR2和CDR3的區(qū)域分別為24aa~34aa,52aa~54aa和91aa~98aa。Fd鏈氨基酸序列的第16、90、137、192、212位氨基酸和κ鏈氨基酸序列的第21、91、137、197、216位氨基酸均為半胱氨酸,可以形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵。 基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果為闡明抗1F2Fab抗體基因的結(jié)構(gòu)特性及進(jìn)一步通過基因改造提高抗體的應(yīng)用價(jià)值打下了基礎(chǔ)。 第四部分EHEC O157:H7 Stx2中和性Fab抗體的可溶表達(dá)及生物學(xué)功能研究 本研究將Pcomb3X-1F2Fab重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL-blue工程菌,30℃下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)14h,收集誘導(dǎo)后重組工程菌超聲破菌上清。間接ELISA檢測(cè)重組工程菌超聲破菌上清,出現(xiàn)陽性結(jié)果;SDS-PAGE檢測(cè)顯示:在Mr約為23KDa處出現(xiàn)1條新的蛋白表達(dá)帶,與1F2Fabκ鏈和Fd鏈預(yù)測(cè)的分子量相近,說明重組子Pcomb3-1F2Fab/XL-blue在IPTG的誘導(dǎo)下能分泌性表達(dá)具有與天然Stx2特異結(jié)合的1F2Fab抗體,但凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果顯示1F2Fab抗體的表達(dá)量低,約為2%。采用Protein L Resin抗體親和層析柱純化1F2Fab抗體,純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE后,采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白純度為95%。Western blot結(jié)果表明,純化后的1F2Fab抗體能與相應(yīng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的天然Stx2 A亞單位蛋白在32KDa處形成單一的蛋白質(zhì)染色帶;競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,1F2Fab抗體能與親本鼠單抗1F2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同一抗原表位,且競(jìng)爭(zhēng)作用隨著抗體濃度增加而加強(qiáng)。根據(jù)50%抑制率時(shí)1F2Fab與親本鼠單抗1F2抗體濃度的比值,可計(jì)算出1F2Fab的親和力為親本鼠單抗1F2的85%。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,抗體的抗原結(jié)合活性隨著抗體濃度的增加而增強(qiáng);在相同抗體濃度時(shí),單抗1F2的結(jié)合力大于1F2Fab。 對(duì)1F2Fab抗體進(jìn)行了初步的體內(nèi)外中和毒素實(shí)驗(yàn),以鑒定其中和活性。研究結(jié)果證實(shí),1F2Fab抗體可抑制天然Stx2毒素對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,20ng/ml的1F2Fab抗體對(duì)Stx2細(xì)胞毒作用的抑制率達(dá)83%;在動(dòng)物體內(nèi),1F2Fab抗體可中和致死劑量的Stx2毒素,提高攻毒小鼠的存活率,劑量為3200ng/kg的1F2Fab抗體對(duì)致死劑量的Stx2攻毒小鼠的保護(hù)率達(dá)到60%(6/10)。 綜上所述,1F2Fab和1F2兩種抗體的成功制備,為下一步分析它們的藥效研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1354010