發(fā)布時(shí)間：2017-12-30 01:22

  本文關(guān)鍵詞：SNAP29在人類成熟中性粒細(xì)胞的表達(dá)、亞細(xì)胞定位與功能研究　出處：《中南大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 背景與目的 人類成熟中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear nutrophil,PMN)含三級(jí)顆粒(tertiary granule,TG)、特異性顆粒(specific granule,SG)、嗜苯胺藍(lán)顆粒(azurophilic granule,AG)與分泌囊泡,在炎癥過(guò)程中,機(jī)體動(dòng)員胞漿顆粒釋放內(nèi)容物,對(duì)機(jī)體抗病原微生物感染具有關(guān)鍵意義。胞漿顆粒內(nèi)容物的釋放必須受到嚴(yán)密調(diào)控,以便產(chǎn)生有效的抗微生物效應(yīng),又避免有害成分釋放失控對(duì)機(jī)體造成過(guò)度損傷。因此,胞漿顆粒內(nèi)容物釋放的調(diào)控機(jī)制成為近年研究的熱點(diǎn)。 胞漿顆粒釋放內(nèi)容物首先要求顆粒膜錨定于胞漿膜并與之融合,兩類膜之間的錨定與融合可能通過(guò)顆粒膜與胞漿膜上特定的蛋白來(lái)調(diào)控的。神經(jīng)遞質(zhì)的釋放即由遞質(zhì)囊泡膜與突觸前膜上一類稱為可溶性N-己烯順丁烯二酰亞胺敏感融合因子附著蛋白受體(SolubleN-ethyl-maleimide sensitive factor attachment protein receptor,SNARE)的蛋白調(diào)節(jié)。在神經(jīng)元SNARE蛋白中,位于神經(jīng)遞質(zhì)囊泡膜上的囊泡相關(guān)膜蛋白2(vesicle-associated membrane protein 2,VAMP 2)與位于突觸前膜上的syntaxin 1A及25kDa的突觸小體相關(guān)蛋白(25kDasynaptosome-associated protein,SNAP 25)結(jié)合成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)遞質(zhì)囊泡膜錨定于突觸前膜并與之融合。受神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)控機(jī)制啟發(fā),人們亦在PMN內(nèi)尋找調(diào)節(jié)胞漿顆粒膜與胞漿膜融合的SNARE蛋白。 已于人PMN與髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞發(fā)現(xiàn)許多調(diào)節(jié)膜融合的SNARE蛋白,包括SNAP-23,-25,syntaxin-1A,-3,-4,-6,-7,-9,-11,VAMP-1,-2,-7等。亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn),SNAP-23,-25與VAMP-2位于靜息中性粒細(xì)胞TG與SG膜;VAMP-1位于靜息中性粒細(xì)胞TG、SG與AG膜;VAMP-7位于靜息中性粒細(xì)胞AG膜;syntaxin-4,-6位于靜息PMN胞漿膜,并且還發(fā)現(xiàn)位于中性粒細(xì)胞TG與SG膜上的SNAP 23,VAMP 2與位于胞漿膜上的syntaxin 6,syntaxin 4能形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)PMN胞漿顆粒錨定于胞漿膜,導(dǎo)致膜融合與顆粒內(nèi)容物釋放。 然而,PMN胞裂外排的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明,尤其對(duì)AG胞裂外排的機(jī)制了解甚少。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究可能存在于人類PMN的其他SNARE蛋白及其亞細(xì)胞分布,首次發(fā)現(xiàn)SNAP 29表達(dá)于人類PMN,并分布于中性粒細(xì)胞TG與SG膜。至于VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4,因其與SNAP 29組成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)PMN胞裂外排(見(jiàn)第二部分),故再次驗(yàn)證其在PMN的表達(dá)與亞細(xì)胞分布。過(guò)去的研究還發(fā)現(xiàn),某些SNARE蛋白(如syntaxin 3與SNAP 23)的編碼基因在PMN表達(dá)A,B兩種亞型,本實(shí)驗(yàn)合成新的引物,擴(kuò)增長(zhǎng)片段基因(syntaxin 4)與過(guò)去未測(cè)序的基因片段(VAMP 1,VAMP 2),并克隆與測(cè)序,研究VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4是否表達(dá)亞型。 方法 (1)采用免疫印跡實(shí)驗(yàn),研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白在PMN內(nèi)的表達(dá)。 (2)采用基因克隆與測(cè)序,研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)基因在PMN內(nèi)的表達(dá)。 (3)用人髓系白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞做研究模型,研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白/基因表達(dá)于HL60細(xì)胞。 半定量RT-PCR研究HL60細(xì)胞向PMN分化過(guò)程中,SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)mRNA表達(dá)水平的變化。 上述實(shí)驗(yàn)為SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白/基因表達(dá)于PMN進(jìn)一步提供佐證。 (4)PMN去核總蛋白、膜蛋白與胞質(zhì)溶膠,用免疫印跡分析法研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)是否為膜結(jié)合蛋白。 (5)蔗糖密度梯度離心分離PMN(包括靜息PMN與PMA活化的PMN)各亞細(xì)胞器,分析各亞細(xì)胞部分特異性標(biāo)記物活性(含量)與溶菌酶活性。各亞細(xì)胞部分進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白在靜息PMN的亞細(xì)胞分布。 (6)15-nm金標(biāo)的抗胞漿顆粒標(biāo)記物(TG、SG與AG的標(biāo)記物分別為明膠酶、乳鐵蛋白與髓過(guò)氧化物酶)抗體標(biāo)記不同胞漿顆粒,10-nm金標(biāo)的抗SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)抗體標(biāo)記SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)陽(yáng)性顆粒,結(jié)合免疫電鏡檢測(cè)術(shù),分析SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)與各胞漿顆粒標(biāo)記物共存于同一顆粒,進(jìn)一步研究SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白在靜息PMN的亞細(xì)胞分布。 結(jié)果 (1)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明,SNAP 29(VAMP1,VAMP2與syntaxin4)蛋白表達(dá)于人PMN。 (2)基因克隆與測(cè)序表明,SNAP 29(VAMP1,VAMP2與syntaxin4)基因表達(dá)于人PMN。 Syntaxin4 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,顯示兩條電泳帶,分別為1278與1414 bp,基因測(cè)序表明,下帶堿基序列與Genbank收錄的syntaxin 4基因序列完全一致,而上帶為下帶堿基序列中插入136個(gè)核苷酸的內(nèi)含子。 未發(fā)現(xiàn)VAMP 1與VAMP 2基因表達(dá)亞型。 (3)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白/基因表達(dá)于HL60細(xì)胞。半定量RT-PCR研究顯示,在HL60細(xì)胞向PMN分化過(guò)程中,SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)mRNA表達(dá)水平上調(diào),并于DMSO誘導(dǎo)分化4天后,其表達(dá)水平近似于PMN的表達(dá)水平,進(jìn)一步證實(shí)了SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白/基因表達(dá)于PMN,并提示SNAP 29蛋白可能是PMN發(fā)揮某些生理功能的必需蛋白。 (4)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)為膜結(jié)合蛋白。 (5)①各亞細(xì)胞部分特異性標(biāo)記物活性測(cè)定結(jié)果顯示,第1部分含胞質(zhì)溶漿;第2、3部分含胞漿膜;第4、5部分含TG;第5、6部分含SG;第7、8部分含AG。 ②溶菌酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,溶菌酶主要位于靜息PMN第4、5、6、7、8亞細(xì)胞部分,即TG、SG與AG。但PMN經(jīng)PMA活化后,第4、5、6部分溶菌酶活性顯著降低,第8部分溶菌酶仍然最高。表明PMA動(dòng)員TG與SG轉(zhuǎn)位至胞漿膜,但較少動(dòng)員AG轉(zhuǎn)位。 ③免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在靜息PMN,SNAP 29位于第4,5,6部分,即TG與SG膜。VAMP 1位于第4,5,6,7,8部分,即TG、SG與AG膜;VAMP 2位于第4,5,6部分,即TG與SG膜;syntaxin 4位于第2,3部分,即胞漿膜。 在PMA活化的PMN,SNAP 29從第4,5,6部分轉(zhuǎn)位至第2,3部分,即胞漿膜;位于第4,5,6部分的VAMP 1轉(zhuǎn)位至胞漿膜,而位于第7,8部分的VAMP 1不發(fā)生轉(zhuǎn)位;VAMP 2從第4,5,6部分轉(zhuǎn)位至胞漿膜;syntaxin 4仍位于第2,3部分,即胞漿膜。 上述結(jié)果表明,位于靜息中性粒細(xì)胞TG與SG膜的SNARE蛋白,在PMN受PMA活化過(guò)程中,均轉(zhuǎn)位至胞漿膜,而位于靜息中性粒細(xì)胞AG膜的SNARE蛋白,在PMN受PMA活化過(guò)程中不發(fā)生轉(zhuǎn)位,與PMA動(dòng)員TG與SG,但不動(dòng)員AG至胞漿膜高度相關(guān),故進(jìn)一步佐證SNAP 29,VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4的亞細(xì)胞分布。 (6)膠體金雙標(biāo)胞漿顆粒結(jié)合免疫電鏡檢測(cè)結(jié)果表明,SNAP 29位于TG與SG膜。VAMP 1位于TG、SG與AG膜;VAMP 2位于TG與SG膜;syntaxin 4位于胞漿膜。 結(jié)論 (1)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)蛋白表達(dá)于人PMN。 (2)SNAP 29(VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4)基因表達(dá)于人PMN。 syntaxin 4除表達(dá)Genbank收錄的基因外,還表達(dá)一個(gè)基因亞型,其中插入有136個(gè)堿基的內(nèi)含子。 未發(fā)現(xiàn)VAMP 1與VAMP 2表達(dá)亞型。 (3)SNAP 29位于靜息中性粒細(xì)胞TG與SG膜。VAMP 1位于TG、SG與AG膜;VAMP 2位于TG與SG膜;syntaxin 4位于胞漿膜。 第二部分 兩個(gè)SNARE復(fù)合體,SNAP29/VAMP1/syntaxin4與SNAP29/VAMP2/syntaxin4,調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞三級(jí)顆粒與特異性顆粒胞裂外排 背景與目的 人類中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear nutrophil,PMN)含三級(jí)顆粒(tertiary granule,TG)、特異性顆粒(specific granule,SG)、嗜苯胺藍(lán)顆粒(azurophilic granule,AG)與分泌囊泡,不同顆粒被動(dòng)員的難易程度存在顯著差異,其中TG與SG易于動(dòng)員,一旦PMN活化即發(fā)生胞裂外排,調(diào)節(jié)PMN的粘附、滲出與殺微生物效應(yīng);AG(含大量溶解酶與殺菌蛋白)最不易被動(dòng)員,其胞裂外排常發(fā)生于對(duì)吞噬小體的處理過(guò)程中。PMN不同胞漿顆粒被動(dòng)員的難易程度不同,提示機(jī)體存在某種機(jī)制,對(duì)PMN不同顆粒的分泌進(jìn)行精確調(diào)控。 在研究神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制過(guò)程中,提出了SNARE(SolubleN-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor)假說(shuō),該假說(shuō)認(rèn)為,位于神經(jīng)遞質(zhì)囊泡膜上的囊泡相關(guān)膜蛋白2(vesicle-associatedmembrane protein 2,VAMP 2)與位于突觸前膜上的syntaxin1A及分子量為25kDa的突觸小體相關(guān)蛋白(25 kDa synaptosome-associatedprotein,SNAP 25)具有共同的約60個(gè)氨基酸的同源基序,在神經(jīng)遞質(zhì)分泌過(guò)程中,同源基序緊密結(jié)合成SNARE復(fù)合體,使囊泡與突觸前膜相互靠近并融合。SNARE復(fù)合體由四個(gè)α螺旋束組成,其中VAMP 2與syntaxin 4各提供一個(gè)α螺旋,SNAP 25提供兩個(gè)α螺旋。所有已知的SNARE基序根據(jù)其中心位點(diǎn)氨基酸種類不同分為兩個(gè)亞家族:即Q-SNARE基序(中心位點(diǎn)為保守的谷氨酰胺殘基)與R-SNARE基序(中心位點(diǎn)為保守的精氨酸殘基)。神經(jīng)元的SNARE復(fù)合體包含三個(gè)Q-SNARE基序(syntaxin 1A提供一個(gè),SNAP 25提供兩個(gè))與一個(gè)R-SNARE基序(VAMP 2提供),形成3(Q-SNARE)/1(R.SNARE)模式。 SNARE蛋白也是PMN分泌過(guò)程中的調(diào)節(jié)蛋白,3(Q-SNARE)/1(R-SNARE)似乎是所有調(diào)節(jié)膜融合的SNARE復(fù)合體的結(jié)構(gòu)范式。根據(jù)SNARE假說(shuō),PMN胞漿顆粒膜上的SNARE蛋白只能與胞漿膜上與之同源的SNARE蛋白結(jié)合,形成3(Q-SNARE)/1(R-SNARE)結(jié)構(gòu)的SNARE復(fù)合體,使胞漿顆粒錨定于胞漿膜并與之融合。不同顆粒膜上SNARE蛋白的種類與密度不同,可能是PMN不同顆粒發(fā)生胞裂外排難易程度存在差異的原因。 已首次發(fā)現(xiàn)SNAP 29表達(dá)于PMN,并位于靜息中性粒細(xì)胞TG與SG膜(見(jiàn)第一部分)。亦已知VAMP 1(位于TG、SG與AG膜),VAMP 2(TG與SG膜)與syntaxin 4(位于胞漿膜)等其他SNARE蛋白表達(dá)于PMN。本實(shí)驗(yàn)旨在研究SNAP 29是否在PMN胞裂外排過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,以及研究與SNAP 29結(jié)合成SNARE復(fù)合體的其他SNARE蛋白及其組合模式。 方法 (1)制備電通透的PMN,孵育不同劑量的抗SNAP 29抗體,然后用Ca~(2+)+GTP-γ-S活化電通透的PMN,多聚甲醛固定,用抗CD66b(TG與SG的特異性標(biāo)志分子)或抗CD63(AG特異性標(biāo)志分子)的抗體孵育細(xì)胞,再孵育FITC偶聯(lián)的熒光二抗,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗SNAP 29抗體對(duì)細(xì)胞活化引起的細(xì)胞表面CD66b或CD63上調(diào)的抑制效應(yīng),研究SNAP 29是否調(diào)節(jié)TG、SG與AG分泌。 同上制備電通透的PMN,用抗VAMP 1,抗VAMP 2或抗syntaxin4抗體孵育,研究VAMP 1,VAMP 2,或syntaxin 4是否調(diào)節(jié)TG、SG與AG分泌。 (2)聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP 29與其他抗體(抗VAMP 1,抗VAMP 2或抗syntaxin 4抗體)孵育電通透的PMN,研究?jī)煞N抗體對(duì)細(xì)胞活化引起的細(xì)胞表面CD66b或CD63上調(diào)的協(xié)同抑制效應(yīng),并推斷SNAP29在調(diào)節(jié)胞漿顆粒分泌過(guò)程中可能形成的SNARE復(fù)合體。 (3)免疫共沉淀研究PMN胞漿顆粒分泌過(guò)程中可能形成的SNARE復(fù)合體。經(jīng)PMA活化的PMN制備蛋白溶漿,用預(yù)先結(jié)合有抗SNAP 29抗體的protein A-Sepharose免疫沉淀PMN活化過(guò)程中可能形成的含SNAP 29的SNARE復(fù)合體。免疫沉淀物用于免疫印跡實(shí)驗(yàn),用抗VAMP 1,抗VAMP 2或抗syntaxin 4等抗體探測(cè)SNAP 29的同源SNARE蛋白。 同理,分別研究VAMP 1,VAMP 2或syntaxin 4的同源SNARE蛋白。 結(jié)果 (1)抗SNAP 29與抗VAMP 2均劑量依賴性抑制PMN活化引起的細(xì)胞表面CD66b上調(diào),但兩者均不抑制CD63上調(diào),表明SNAP29與VAMP 2均調(diào)節(jié)TG與SG分泌,但均不調(diào)節(jié)AG分泌。 抗VAMP 1與抗syntaxin 4均劑量依賴性抑制CD66b與CD63上調(diào),表明VAMP 1與syntaxin 4均調(diào)節(jié)TG、SG與AG分泌。 (2)聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP 29與抗VAMP 1,協(xié)同抑制CD66b上調(diào),但對(duì)CD63上調(diào)的抑制效應(yīng),與單用VAMP 1相同,表明SNAP 29可能與TG及SG上的VAMP 1形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG分泌,但AG的分泌受VAMP 1調(diào)節(jié),而不受SNAP 29調(diào)節(jié)。 聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP 29與抗VAMP 2,協(xié)同抑制CD66b上調(diào),但不抑制CD63上調(diào),表明SNAP 29與VAMP 2可能形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG分泌,但兩者均不調(diào)節(jié)AG分泌。 聯(lián)合應(yīng)用抗SNAP29與抗syntaxin4,協(xié)同抑制CD66b上調(diào),但對(duì)CD63上調(diào)的抑制效應(yīng),與單用syntaxin 4相同,表明SNAP29與syntaxin 4可能形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG分泌,但AG的分泌受syntaxin 4調(diào)節(jié),而不受SNAP 29調(diào)節(jié)。 聯(lián)合應(yīng)用抗VAMP 1與抗syntaxin 4,協(xié)同抑制CD66b與CD63上調(diào),表明TG及SG上的VAMP 1,可能與胞漿膜上的syntaxin4相互作用形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG分泌;位于AG上的VAMP1與位于胞漿膜的syntaxin 4亦可能形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)AG分泌。 聯(lián)合應(yīng)用抗VAMP 2與抗syntaxin 4,協(xié)同抑制CD66b上調(diào),但對(duì)CD63上調(diào)的抑制效應(yīng),與單用syntaxin 4相同,表明VAMP 2與syntaxin 4可能形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG分泌,但AG分泌受syntaxin 4調(diào)節(jié),而不受VAMP 2調(diào)節(jié)。 綜合抗體聯(lián)合抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果,SNAP 29可能形成兩個(gè)SNARE復(fù)合體,即:SNAP 29/VAMP 1/syntaxin 4與SNAP 29/VAMP 2/syntaxin 4,調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞TG與SG胞裂外排;VAMP 1與syntaxin4亦可能形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)AG分泌。 (3)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PMA(動(dòng)員TG與SG)活化的PMN蛋白溶漿,抗SNAP 29抗體能免疫沉淀VAMP 1,VAMP 2與syntaxin4,表明SNAP 29能與VAMP 1,VAMP 2和syntaxin 4中任一蛋白形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG胞裂外排。 抗VAMP 2抗體能免疫沉淀SNAP 29與syntaxin 4,但不能免疫沉淀VAMP 1,表明VAMP 2能與SNAP 29和syntaxin 4中任一蛋白形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG胞裂外排,但VAMP 2與VAMP1不形成SNARE復(fù)合體。 抗syntaxin 4抗體能免疫沉淀SNAP 29,VAMP 1與VAMP 2,表明syntaxin 4能與SNAP 29,VAMP 1和VAMP 2中任一蛋白形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG胞裂外排。 fMLP(動(dòng)員TG、SG與AG)活化的PMN蛋白溶漿,抗syntaxin 4抗體能免疫沉淀SNAP 29,VAMP 1與VAMP 2,且沉淀VAMP 1的量,顯著多于PMA(動(dòng)員TG與SG)活化的PMN蛋白溶漿中沉淀的VAMP 1的量,表明syntaxin 4不僅與TG及SG上的VAMP 1形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)TG與SG分泌,而且與AG上的VAMP 1形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)AG分泌(見(jiàn)正文附圖)。 綜合免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果,SNAP 29可能形成兩個(gè)SNARE復(fù)合體,即:SNAP 29/VAMP 1/syntaxin 4與SNAP 29/VAMP 2/syntaxin4,調(diào)節(jié)TG與SG分泌。VAMP 1與syntaxin 4亦可能形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)AG分泌。VAMP 1與VAMP 2不共存于同一個(gè)SNARE復(fù)合體。 結(jié)論 (1)SNAP 29,VAMP 1,VAMP 2與syntaxin 4皆調(diào)節(jié)PMN胞漿顆粒分泌。 (2)SNAP 29與VAMP 2調(diào)節(jié)TG與SG分泌;VAMP 1與syntaxin4調(diào)節(jié)TG、SG與AG分泌。 (3)兩個(gè)SNARE復(fù)合體,SNAP 29/VAMP 1/syntaxin 4與SNAP 29/VAMP 2/syntaxin 4,調(diào)節(jié)TG與SG分泌。VAMP 1與syntaxin 4形成SNARE復(fù)合體,調(diào)節(jié)AG分泌。VAMP 1與VAMP 2不共存于同一SNARE復(fù)合體。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1352727