本文關鍵詞：TAT-PDX1蛋白誘導的人胎肝間充質(zhì)干細胞分化為胰島β樣細胞的研究　出處：《暨南大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 目的: 探討人胎肝來源的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells derived fromhuman fetal liver,hFLMSCs)的分離和特性;用轉(zhuǎn)錄子TAT-PDX1(trans activitortranscription-pancreatic duodenal homeoboxl)蛋白誘導其分化為胰島β樣細胞能力,以及分化細胞表達胰島素定性和治療NOD/SCID鼠糖尿病的效果。 方法: 取12-20周流產(chǎn)胎兒肝臟,剪切、吹打胎肝組織獲取肝細胞懸液,通過二步離心收集肝非實質(zhì)細胞,再用羥乙基淀粉沉淀紅細胞,從而使有核細胞得到富集。接種、培養(yǎng)上述細胞,利用細胞差速貼壁生長的特性純化hFLMSCs。流式細胞儀檢測hFLMSCs的細胞周期和表面標志,對P10代及凍存半年后復蘇的hFLMSCs進行染色體分析,用經(jīng)典方法誘導hFLMSCs向脂肪細胞、成骨細胞分化。 用TAT-PDX1蛋白為主的方案體外誘導P3 hFLMSCs分化為胰島β細胞,觀察細胞形態(tài)變化,用RT-PCR方法檢測基因的表達情況,用雙硫腙染色,免疫熒光染色檢測胰島素、C-肽的表達。用化學發(fā)光法測定胰島素累積分泌量并用胰島素釋放實驗檢測分化的細胞對葡萄糖的反應性;并用Western blot的方法檢測胰島素的表達情況。 用STZ腹腔注射制作NOD/SCID鼠糖尿病模型,并將誘導后的細胞移植到糖尿病鼠左腎包膜下,動態(tài)觀察血糖變化及糖尿病癥狀變化情況,測定移植前后小鼠胰島素、C-肽水平,并行腹腔糖耐量試驗檢測移植細胞對血糖變化的反應情況。 對血糖降至正常的小鼠,摘除其左腎以觀察血糖是否反彈,對摘除的小鼠的腎臟進行免疫組化檢測,以及用RT-PCR的方法檢測胰島素表達相關基因的情況。 結果: 從人胎兒肝臟中分離、純化得到梭形貼壁的MSCs;P3代hFLMSCs均有90%以上處于GO/GI期,表達CD90、CD105和CD166,不表達CD14、CD34、CD45以及AFP、HLA-DR等;在多次傳代(P10代)及凍存半年后復蘇仍保持正常核型。在常規(guī)誘導條件下,hFLMSCs可分化為成脂細胞、成骨細胞等。 用TAT-PDX1蛋白為主的方案體外誘導后,細胞快速變成圓形或橢圓形,并聚集形成越來越多的胰島樣細胞團;RT-PCR結果顯示胰島樣細胞團表達胰島相關基因,如Neuro D、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pax6、Isl-1和PDX1等;經(jīng)雙硫腙染色后呈現(xiàn)棕紅色陽性反應;激光共聚焦顯微鏡檢測細胞團中胰島素、C-肽等胰島特異性蛋白表達陽性;化學發(fā)光法測得培養(yǎng)液上清中胰島素累積分泌量逐漸增加,而且隨著時間延長分泌量維持在較高水平;胰島素釋放實驗表明胰島樣細胞團具有一定的糖反應性;Western blot證實誘導分化的胰島樣細胞團蛋白提取物中有胰島素的表達。 用STZ腹腔注射制作NOD/SCID鼠糖尿病模型成模率高,移植胰島樣細胞團到糖尿病小鼠的腎包膜下,可觀察到小鼠的血糖逐漸下降,而非移植組糖尿病小鼠則持續(xù)高血糖;移植前后小鼠的胰島素、C-肽水平有顯著性差異,腹腔糖耐量試驗檢測到移植細胞對血糖變化有反應。 摘除血糖降至正常的小鼠左腎,可見血糖出現(xiàn)反彈,再次升高;該鼠腎被膜下移植物的免疫組織化學染色可以看到胰島素陽性細胞。取小鼠左腎,用RT-PCR的方法檢測到人胰島素相關基因(Nkx2.2、Nkx6.1、Pax6、Isl-1 and PDX1)的表達。 結論: 人12-20周流產(chǎn)胎兒肝臟含有MSCs,能在體外培養(yǎng)和擴增,hFLMSCs強表達CD90、CD105和CD166,不表達CD14、CD34、CD45以及AFP、HLA-DR等;hFLMSCs具有很強的多向分化能力,且免疫原性弱,能長時間保持正常核型,可以作為人類組織工程和再生醫(yī)學研究的種子細胞。用TAT-PDX1蛋白為主的方案體外誘導hFLMSCs能分化為胰島β樣細胞并穩(wěn)定表達胰島素;移植到糖尿病鼠腎包膜下,能快速降低血糖水平;取出移植物,血糖水平再次升高。
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【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

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