本文關(guān)鍵詞：TAT-PDX1蛋白誘導(dǎo)的人胎肝間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島β樣細(xì)胞的研究　出處：《暨南大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的: 探討人胎肝來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells derived fromhuman fetal liver,hFLMSCs)的分離和特性;用轉(zhuǎn)錄子TAT-PDX1(trans activitortranscription-pancreatic duodenal homeoboxl)蛋白誘導(dǎo)其分化為胰島β樣細(xì)胞能力,以及分化細(xì)胞表達(dá)胰島素定性和治療NOD/SCID鼠糖尿病的效果。 方法: 取12-20周流產(chǎn)胎兒肝臟,剪切、吹打胎肝組織獲取肝細(xì)胞懸液,通過二步離心收集肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,再用羥乙基淀粉沉淀紅細(xì)胞,從而使有核細(xì)胞得到富集。接種、培養(yǎng)上述細(xì)胞,利用細(xì)胞差速貼壁生長的特性純化hFLMSCs。流式細(xì)胞儀檢測hFLMSCs的細(xì)胞周期和表面標(biāo)志,對(duì)P10代及凍存半年后復(fù)蘇的hFLMSCs進(jìn)行染色體分析,用經(jīng)典方法誘導(dǎo)hFLMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化。 用TAT-PDX1蛋白為主的方案體外誘導(dǎo)P3 hFLMSCs分化為胰島β細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,用RT-PCR方法檢測基因的表達(dá)情況,用雙硫腙染色,免疫熒光染色檢測胰島素、C-肽的表達(dá)。用化學(xué)發(fā)光法測定胰島素累積分泌量并用胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測分化的細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性;并用Western blot的方法檢測胰島素的表達(dá)情況。 用STZ腹腔注射制作NOD/SCID鼠糖尿病模型,并將誘導(dǎo)后的細(xì)胞移植到糖尿病鼠左腎包膜下,動(dòng)態(tài)觀察血糖變化及糖尿病癥狀變化情況,測定移植前后小鼠胰島素、C-肽水平,并行腹腔糖耐量試驗(yàn)檢測移植細(xì)胞對(duì)血糖變化的反應(yīng)情況。 對(duì)血糖降至正常的小鼠,摘除其左腎以觀察血糖是否反彈,對(duì)摘除的小鼠的腎臟進(jìn)行免疫組化檢測,以及用RT-PCR的方法檢測胰島素表達(dá)相關(guān)基因的情況。 結(jié)果: 從人胎兒肝臟中分離、純化得到梭形貼壁的MSCs;P3代hFLMSCs均有90%以上處于GO/GI期,表達(dá)CD90、CD105和CD166,不表達(dá)CD14、CD34、CD45以及AFP、HLA-DR等;在多次傳代(P10代)及凍存半年后復(fù)蘇仍保持正常核型。在常規(guī)誘導(dǎo)條件下,hFLMSCs可分化為成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。 用TAT-PDX1蛋白為主的方案體外誘導(dǎo)后,細(xì)胞快速變成圓形或橢圓形,并聚集形成越來越多的胰島樣細(xì)胞團(tuán);RT-PCR結(jié)果顯示胰島樣細(xì)胞團(tuán)表達(dá)胰島相關(guān)基因,如Neuro D、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pax6、Isl-1和PDX1等;經(jīng)雙硫腙染色后呈現(xiàn)棕紅色陽性反應(yīng);激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞團(tuán)中胰島素、C-肽等胰島特異性蛋白表達(dá)陽性;化學(xué)發(fā)光法測得培養(yǎng)液上清中胰島素累積分泌量逐漸增加,而且隨著時(shí)間延長分泌量維持在較高水平;胰島素釋放實(shí)驗(yàn)表明胰島樣細(xì)胞團(tuán)具有一定的糖反應(yīng)性;Western blot證實(shí)誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞團(tuán)蛋白提取物中有胰島素的表達(dá)。 用STZ腹腔注射制作NOD/SCID鼠糖尿病模型成模率高,移植胰島樣細(xì)胞團(tuán)到糖尿病小鼠的腎包膜下,可觀察到小鼠的血糖逐漸下降,而非移植組糖尿病小鼠則持續(xù)高血糖;移植前后小鼠的胰島素、C-肽水平有顯著性差異,腹腔糖耐量試驗(yàn)檢測到移植細(xì)胞對(duì)血糖變化有反應(yīng)。 摘除血糖降至正常的小鼠左腎,可見血糖出現(xiàn)反彈,再次升高;該鼠腎被膜下移植物的免疫組織化學(xué)染色可以看到胰島素陽性細(xì)胞。取小鼠左腎,用RT-PCR的方法檢測到人胰島素相關(guān)基因(Nkx2.2、Nkx6.1、Pax6、Isl-1 and PDX1)的表達(dá)。 結(jié)論: 人12-20周流產(chǎn)胎兒肝臟含有MSCs,能在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增,hFLMSCs強(qiáng)表達(dá)CD90、CD105和CD166,不表達(dá)CD14、CD34、CD45以及AFP、HLA-DR等;hFLMSCs具有很強(qiáng)的多向分化能力,且免疫原性弱,能長時(shí)間保持正常核型,可以作為人類組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究的種子細(xì)胞。用TAT-PDX1蛋白為主的方案體外誘導(dǎo)hFLMSCs能分化為胰島β樣細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)胰島素;移植到糖尿病鼠腎包膜下,能快速降低血糖水平;取出移植物,血糖水平再次升高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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