本文關(guān)鍵詞：Rac1與神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化關(guān)系的研究　出處：《蘇州大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的探討Rac1與神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化的關(guān)系,對(duì)于揭示神經(jīng)干/前體細(xì)胞增殖分化的分子機(jī)制,具有重要的理論意義;為有效利用神經(jīng)前體細(xì)胞治療神經(jīng)性疾病或促進(jìn)神經(jīng)損傷后修復(fù)提供理論依據(jù)。 方法本實(shí)驗(yàn)從三個(gè)方面來(lái)研究Rac1與神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化的關(guān)系:(1)取新生SD大鼠大腦皮層,原代培養(yǎng)獲得混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系,在10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d,細(xì)胞匯合后更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)4個(gè)時(shí)間點(diǎn),即無(wú)血清培養(yǎng)0 d、2 d、4 d、10 d,用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞增殖分化的變化,免疫熒光染色技術(shù)鑒定細(xì)胞種類以及Rac1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),通過(guò)Western blot檢測(cè)Rac1及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。Pull-down assay檢測(cè)分析Rac1及相關(guān)蛋白活性變化。(2)在新生SD大鼠大腦皮層原代混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)6 d時(shí),采用體外劃傷方式造成一個(gè)約1 mm的細(xì)胞損傷,更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。O-2A前體細(xì)胞遷移到損傷區(qū)域,對(duì)遷移到損傷區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行A2B5、Rac1蛋白的免疫熒光染色,研究O-2A前體細(xì)胞中Rac1的表達(dá)。(3)取新生大鼠大腦皮層,混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)7-9天,采用恒溫震蕩差速貼壁法分離純化O-2A前體細(xì)胞,通過(guò)A2B5、GFAP免疫熒光染色法鑒定O-2A前體細(xì)胞及2型星形膠質(zhì)細(xì)胞;同時(shí)利用Western blot和Pull-down assay檢測(cè)O-2A前體細(xì)胞分化過(guò)程中Rac1、Cdc42及活性蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果(1)建立了新生SD大鼠大腦皮層原代混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系,此體系底層主要是由Ⅰ型星形膠質(zhì)細(xì)胞組成的單層細(xì)胞,GFAP染色呈陽(yáng)性;在單層細(xì)胞上面有一些小圓形強(qiáng)折光性神經(jīng)前體細(xì)胞生長(zhǎng),β-Ⅲ-Tubulin染色呈陽(yáng)性。更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)0 d-4 d期間上層神經(jīng)前體細(xì)胞大量增殖,無(wú)血清培養(yǎng)4 d后,神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,β-Ⅲ-Tubulin、Rac1染色呈陽(yáng)性。Western blot定量結(jié)果分析顯示,無(wú)血清培養(yǎng)4 d時(shí)神經(jīng)前體細(xì)胞的Rac1蛋白表達(dá)水平明顯高于無(wú)血清培養(yǎng)0 d時(shí)的表達(dá)水平,隨后神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,無(wú)血清培養(yǎng)10 d后神經(jīng)前體細(xì)胞Rac1表達(dá)水平明顯低于無(wú)血清培養(yǎng)4 d時(shí)的表達(dá)水平。Pull-down沉降Rac1活性蛋白,結(jié)果分析顯示無(wú)血清培養(yǎng)4 d、10 d時(shí)Rac1活性蛋白表達(dá)水平高于無(wú)血清培養(yǎng)0 d的表達(dá)水平,即Rac1活性蛋白在神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化過(guò)程的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。此外,Cdc42蛋白在神經(jīng)前體細(xì)胞增殖過(guò)程中表達(dá)無(wú)變化,而分化過(guò)程中表達(dá)下降;Cdc42活性蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。(2)建立了體外新生SD大鼠大腦皮層混合膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型,細(xì)胞損傷后換無(wú)血清培養(yǎng),O-2A前體細(xì)胞遷移到損傷區(qū)域,分化為2型星形膠質(zhì)細(xì)胞并修復(fù)損傷區(qū)域。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Rac1蛋白在O-2A前體細(xì)胞遷移分化過(guò)程中始終表達(dá)。(3)成功分離純化出O-2A前體細(xì)胞,細(xì)胞呈橢圓形,有典型的雙極突起,A2B5免疫熒光染色呈陽(yáng)性;在有血清和無(wú)血清培養(yǎng)基中分別分化為2型星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。分化過(guò)程中Rac1、Cdc42蛋白的表達(dá)下降,而Rac1、Cdc42活性蛋白表達(dá)上升。Western blot定量結(jié)果分析顯示,未分化的O-2A前體細(xì)胞的Rac1蛋白表達(dá)水平明顯高于分化成熟的2型星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)水平,具有顯著性差異(p0.05)。Pull-down沉降Rac1活性蛋白,結(jié)果顯示分化成熟的2型星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的Rac1蛋白表達(dá)水平明顯高于未分化的O-2A前體細(xì)胞的表達(dá)水平。另外,在O-2A前體細(xì)胞分化過(guò)程中Cdc42蛋白的表達(dá)下降,活性蛋白表達(dá)上升,與Rac1的變化一致。 結(jié)論Rac1與神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖分化過(guò)程密切相關(guān),在神經(jīng)前體細(xì)胞增殖過(guò)程中Rac1蛋白表達(dá)上升,而分化過(guò)程中Rac1蛋白表達(dá)下降。Rac1活性蛋白表達(dá)促進(jìn)了神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖以及分化。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 薛妍,畢鋒,劉娜,潘陽(yáng)林,時(shí)永全,張學(xué)庸;Rho GTPases對(duì)腫瘤血管生成相關(guān)分子的作用[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2004年05期

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本文編號(hào)：1348210