本文關鍵詞：Rac1與神經(jīng)前體細胞增殖分化關系的研究　出處：《蘇州大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 目的探討Rac1與神經(jīng)前體細胞增殖分化的關系,對于揭示神經(jīng)干/前體細胞增殖分化的分子機制,具有重要的理論意義;為有效利用神經(jīng)前體細胞治療神經(jīng)性疾病或促進神經(jīng)損傷后修復提供理論依據(jù)。 方法本實驗從三個方面來研究Rac1與神經(jīng)前體細胞增殖分化的關系:(1)取新生SD大鼠大腦皮層,原代培養(yǎng)獲得混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)體系,在10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d,細胞匯合后更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實驗中設計4個時間點,即無血清培養(yǎng)0 d、2 d、4 d、10 d,用倒置相差顯微鏡觀察細胞增殖分化的變化,免疫熒光染色技術(shù)鑒定細胞種類以及Rac1蛋白在細胞內(nèi)的表達,通過Western blot檢測Rac1及相關蛋白的表達變化。Pull-down assay檢測分析Rac1及相關蛋白活性變化。(2)在新生SD大鼠大腦皮層原代混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)6 d時,采用體外劃傷方式造成一個約1 mm的細胞損傷,更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。O-2A前體細胞遷移到損傷區(qū)域,對遷移到損傷區(qū)域的細胞進行A2B5、Rac1蛋白的免疫熒光染色,研究O-2A前體細胞中Rac1的表達。(3)取新生大鼠大腦皮層,混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)7-9天,采用恒溫震蕩差速貼壁法分離純化O-2A前體細胞,通過A2B5、GFAP免疫熒光染色法鑒定O-2A前體細胞及2型星形膠質(zhì)細胞;同時利用Western blot和Pull-down assay檢測O-2A前體細胞分化過程中Rac1、Cdc42及活性蛋白的表達變化。 結(jié)果(1)建立了新生SD大鼠大腦皮層原代混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)體系,此體系底層主要是由Ⅰ型星形膠質(zhì)細胞組成的單層細胞,GFAP染色呈陽性;在單層細胞上面有一些小圓形強折光性神經(jīng)前體細胞生長,β-Ⅲ-Tubulin染色呈陽性。更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)0 d-4 d期間上層神經(jīng)前體細胞大量增殖,無血清培養(yǎng)4 d后,神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元方向分化,β-Ⅲ-Tubulin、Rac1染色呈陽性。Western blot定量結(jié)果分析顯示,無血清培養(yǎng)4 d時神經(jīng)前體細胞的Rac1蛋白表達水平明顯高于無血清培養(yǎng)0 d時的表達水平,隨后神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元方向分化,無血清培養(yǎng)10 d后神經(jīng)前體細胞Rac1表達水平明顯低于無血清培養(yǎng)4 d時的表達水平。Pull-down沉降Rac1活性蛋白,結(jié)果分析顯示無血清培養(yǎng)4 d、10 d時Rac1活性蛋白表達水平高于無血清培養(yǎng)0 d的表達水平,即Rac1活性蛋白在神經(jīng)前體細胞增殖分化過程的表達呈現(xiàn)上升趨勢。此外,Cdc42蛋白在神經(jīng)前體細胞增殖過程中表達無變化,而分化過程中表達下降;Cdc42活性蛋白表達呈現(xiàn)上升趨勢。(2)建立了體外新生SD大鼠大腦皮層混合膠質(zhì)細胞損傷模型,細胞損傷后換無血清培養(yǎng),O-2A前體細胞遷移到損傷區(qū)域,分化為2型星形膠質(zhì)細胞并修復損傷區(qū)域。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Rac1蛋白在O-2A前體細胞遷移分化過程中始終表達。(3)成功分離純化出O-2A前體細胞,細胞呈橢圓形,有典型的雙極突起,A2B5免疫熒光染色呈陽性;在有血清和無血清培養(yǎng)基中分別分化為2型星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。分化過程中Rac1、Cdc42蛋白的表達下降,而Rac1、Cdc42活性蛋白表達上升。Western blot定量結(jié)果分析顯示,未分化的O-2A前體細胞的Rac1蛋白表達水平明顯高于分化成熟的2型星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的表達水平,具有顯著性差異(p0.05)。Pull-down沉降Rac1活性蛋白,結(jié)果顯示分化成熟的2型星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的Rac1蛋白表達水平明顯高于未分化的O-2A前體細胞的表達水平。另外,在O-2A前體細胞分化過程中Cdc42蛋白的表達下降,活性蛋白表達上升,與Rac1的變化一致。 結(jié)論Rac1與神經(jīng)前體細胞的增殖分化過程密切相關,在神經(jīng)前體細胞增殖過程中Rac1蛋白表達上升,而分化過程中Rac1蛋白表達下降。Rac1活性蛋白表達促進了神經(jīng)前體細胞的增殖以及分化。
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【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 薛妍,畢鋒,劉娜,潘陽林,時永全,張學庸;Rho GTPases對腫瘤血管生成相關分子的作用[J];中國生物化學與分子生物學報;2004年05期

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本文編號：1348210