發(fā)布時間：2017-12-28 13:27

  本文關(guān)鍵詞：ICAM-1介導(dǎo)的脈沖電刺激下血管內(nèi)皮細胞與祖細胞粘附的實驗研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 研究背景與目的 生物電是人體的固有屬性,伴隨著每個生命活動的完成；細胞是機體基本組成單位,細胞膜內(nèi)外某些帶電離子分布和濃度不同以及細胞膜對不同離子的選擇通透性,正是細胞、組織形成跨膜電位的條件,也是生物電的起源。正常情況下,細胞間緊密連接的存在可使跨膜電位均等分布于相應(yīng)組織當(dāng)中,組織一旦損傷,完整的細胞間緊密連接不復(fù)存在,損傷處局部跨膜電位即被削弱,健側(cè)部位的高電勢和損傷病灶的低電勢隨即形成一內(nèi)生電場。由于內(nèi)生電場激活了病變組織細胞及其周圍細胞修復(fù)信號的傳遞,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生損傷修復(fù)效應(yīng),因此,如何深化認識內(nèi)生電場修復(fù)作用并加以利用則顯得十分重要。 基于此背景,生物電刺激在血管再生領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)積累了一定的數(shù)據(jù),有關(guān)策略主要圍繞以下兩個方面：第一,外部施加生物電刺激直接促進機體內(nèi)血管再生,相當(dāng)于彌補并強化內(nèi)生電場誘導(dǎo)產(chǎn)生的修復(fù)效應(yīng)；第二,以構(gòu)建組織工程化血管為中心,通過生物電刺激的干預(yù),從排列、粘附和抗性等方面增強種子細胞與生物材料的整合。由于血管內(nèi)皮細胞覆蓋所有類型血管并密切接觸血流,同時也是新生血管形成的首要環(huán)節(jié),故目前電刺激研究多集中于血管內(nèi)皮細胞功能學(xué)的改變。然而,研究表明僅僅依賴于血管內(nèi)皮增殖或出芽等原位修復(fù)并不能滿足重建血管、改善血流的需要,內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cell, EPC)的發(fā)生發(fā)展已被證實對成體血管再生有著不可替代的作用,新生血管形成的研究方向逐漸由傳統(tǒng)的血管形成過渡至EPC介導(dǎo)的血管發(fā)生。那么EPC將如何參與到電刺激促新生血管形成過程?該問題的探討十分有意義。 隨著EPC探索的深入,EPC研究已由改良培養(yǎng)方法和分析增殖分化能力為主的策略演變?yōu)閷毎麣w巢信號的重點探索。EPC歸巢,指在缺血損傷的應(yīng)激代償反應(yīng)中,EPC因缺血部位趨化因子的誘導(dǎo)而產(chǎn)生動員和定向遷移,然后在血管內(nèi)皮層上緩慢移動,繼而與血管內(nèi)皮產(chǎn)生緊密粘附并完成跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移,最后通過直接分化和分泌等形式來完成修復(fù)反應(yīng)。經(jīng)證實,EPC與血管內(nèi)皮之間的粘附在整個歸巢過程當(dāng)中起著承上啟下的作用,已知多對粘附分子組合參與此調(diào)節(jié)過程。其中細胞間粘附分子-1 (Intercellular adhesion molecule, ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族成員,其在血管內(nèi)皮細胞膜上的表達不僅介導(dǎo)了細胞間的粘附,更重要的是通過這種結(jié)合,可將外界損傷刺激信號沿著EPC膜上配體整合素αvβ2,尤其是整合素β2,傳遞至EPC胞內(nèi),然后啟動后續(xù)生物學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),在粘附分子調(diào)控的歸巢過程當(dāng)中最為關(guān)鍵。那么血管內(nèi)皮在適宜電刺激的調(diào)節(jié)下能否增強自身與EPC的粘附?電刺激促進血管內(nèi)皮捕獲循環(huán)EPC的機制又是否與ICAM-1的上調(diào)有關(guān)?國內(nèi)外未見同類型報道,這是開展本課題研究的主要目的。 為驗證我們的設(shè)想,本課題研究分為三個部分： (1)自主研制具有適合刺激形式的電刺激儀,獲得人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)并建立細胞培養(yǎng)電刺激模型,首先評價電刺激下培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性、HUVEC形態(tài)學(xué)和增殖活性的改變； (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)外周血EPC并進行鑒定,通過熒光標(biāo)記EPC以衡量電刺激下HUVEC與EPC之間粘附強度的改變； (3)檢測電刺激下HUVEC ICAM-1的表達水平,以期探索電刺激影響HUVEC捕獲EPC的可能機制。 方法 (1)電刺激儀的研制與評價 聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院醫(yī)學(xué)工程系,自主研制脈沖輸出形式的電刺激儀；固定刺激脈寬和頻率為最大值,伏安法檢測不同電壓幅度刺激下2h內(nèi)培養(yǎng)液電阻,并且探測局部溫度的變化； (2)電刺激對HUVEC形態(tài)學(xué)以及增殖活性的影響 膠原酶消化法分離HUVEC,結(jié)合形態(tài)學(xué)和Ⅷ因子相關(guān)抗原對其鑒定；將HUVEC分為不同參數(shù)刺激組和常規(guī)培養(yǎng)組,刺激24h后觀察HUVEC形態(tài)學(xué)變化,MTS法比較HUVEC增殖活性的差異； (3)電刺激對HUVEC與EPC之間粘附強度的影響 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,專用培養(yǎng)基直接誘導(dǎo)培養(yǎng)外周血EPC,于第9天進行免疫熒光鑒定(乙�；兔芏戎鞍缀颓G豆類凝集素)以及表面標(biāo)志流式分析(CD34、CD133、CD31、VEGFR2和CD14)； 取第9天EPC,活性熒光染料CFSE標(biāo)記后接種在單層HUVEC上,不同參數(shù)電刺激培養(yǎng)24h,顯微鏡下觀察貼壁熒光標(biāo)記EPC數(shù)量,熒光酶標(biāo)儀讀取細胞熒光強度,以熒光比率衡量粘附強度。 (4)電刺激對HUVEC ICAM-1表達的影響 24h培養(yǎng)結(jié)束后分別收集不同參數(shù)電刺激組和常規(guī)培養(yǎng)組細胞的總RNA,采用Real time PCR技術(shù)中的SYBR Green染料法,運用2-ΔΔCt法對各實驗組中HUVEC ICAM-1 mRNA相對表達量進行分析。 (5)統(tǒng)計學(xué)方法： 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,表面標(biāo)志陽性率比較采用配對t檢驗,多組間不同時間點電阻比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,多組間溫度比較、熒光比率比較采用完全隨機設(shè)計方差分析,多組間細胞增殖活性比較、基因表達量比較采用隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析：方差齊時采用Fisher法,多重比較用Bonferroni法；方差不齊時則用Welch近似法,多重比較用Dunnett T3法,P0.05視為具有顯著性差異,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件計算。 結(jié)果 (1)電刺激儀的研制與評價 自主研制電刺激儀可提供幅度(0-±40V)、頻率(0.01-10 Hz)、脈寬(0.1-24 ms)均可調(diào)的雙相脈沖輸出,配合C-Dish電極板使用共同構(gòu)成細胞培養(yǎng)電刺激模型。固定最大脈寬和最大頻率,采用伏安法測得2h內(nèi)不同刺激電壓強度下(0V、5V、10V、20V、和40V)培養(yǎng)液電阻存在顯著性差異(F=174.14,P=0.000),電壓強度與刺激時間存在交互效應(yīng)(F=74.12,P=0.000),不同電壓幅度下培養(yǎng)液電阻在不同刺激時間點的變化趨勢不同。培養(yǎng)液電阻和局部溫度均以10V以內(nèi)電壓幅度相對穩(wěn)定,表示此范圍內(nèi)電解反應(yīng)恒定,可在此基礎(chǔ)上進行后續(xù)細胞學(xué)實驗。 (2)電刺激對HUVEC形態(tài)學(xué)以及增殖活性的影響 取第2或第3代HUVEC進行實驗,選擇10V內(nèi)不同刺激參數(shù)組合,首先通過觀察刺激24h后HUVEC形態(tài)學(xué)變化以進一步縮窄刺激范圍,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5V/5Hz/9ms刺激下細胞主要表現(xiàn)為體積增大、更扁平、長梭形伸展,核周深染區(qū)牽拉細長,與細胞長軸一致,并且可隨著任一刺激參數(shù)的增高而出現(xiàn)空泡變性、甚至脫落；隨后固定脈寬、頻率分別為5V和5Hz,采用MTS法檢測不同脈寬(0ms、1ms、3ms、6ms、9ms)刺激下HUVEC增殖活性,以排除增殖活性差異對粘附強度變化造成的干擾,各組OD值分別為1.457、1.471、1.469、1.461和1.458,尚不能認為各實驗組間HUVEC增殖活性存在顯著性差異(F=1.822,P=0.218)。 (3)電刺激對HUVEC與EPC之間粘附強度的影響 外周血EPC呈長條狀分布,整體密度和狀態(tài)均以第9天最佳,可同時吞噬乙�；兔芏戎鞍缀徒Y(jié)合荊豆類凝集素,Ⅷ因子相關(guān)抗原逐漸增強,表面標(biāo)志CD34、CD133、CD31、VEGFR2、CD14陽性率分別為0.19±0.06%,1.67±0.52%,61.56±5.57%,70.29±7.37%,89.31±4.11%,屬于正在分化的EPC,符合早期EPC范疇；活性熒光染料CFSE標(biāo)記第9天收集的EPC,熒光法分析不同脈寬刺激下HUVEC與EPC粘附強度的變化。經(jīng)換算,常規(guī)培養(yǎng)組、1ms、3ms、6ms和9ms刺激組熒光比率分別為0.441、0.470、0.489、0.557和0.370,各實驗組間熒光比率存在顯著性差異(F=62.165,P=0.000),與常規(guī)培養(yǎng)組相比,6ms刺激組增高最顯著,可見適宜雙相脈沖電刺激在一定程度上有利于HUVEC與EPC之間的粘附。相反,9ms刺激組熒光比率下降,顯著低于常規(guī)培養(yǎng)組水平。 (4)電刺激對HUVEC ICAM-1表達的影響 Real time PCR檢測結(jié)果顯示,與常規(guī)培養(yǎng)組相比,lms、3ms、6ms和9ms刺激組相對表達量分別為1.23、2.42、3.79和1.90,不同脈寬刺激下HUVEC ICAM-1 mRNA相對表達量存在顯著性差異(F=17.706, P=0.000),并在一定范圍內(nèi)隨著脈寬的延長而增高,其中6ms刺激組表達量增高最顯著,9ms刺激組呈現(xiàn)下降跡象,但仍高于正常水平。 結(jié)論 (1)成功研制出具有雙相脈沖輸出的電刺激儀,并且建立了相對穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)刺激模型,在固定5V和5Hz的前提下,HUVEC形態(tài)改變明顯,呈扁平長梭形伸展,但其增殖活性并不隨著刺激脈寬的延長(0、1、3、6、9ms)而改變； (2)成功從外周血單個核細胞中直接誘導(dǎo)培養(yǎng)出EPC,經(jīng)鑒定,細胞符合正在分化的早期EPC表型； (3)雙相脈沖電刺激在一定范圍內(nèi)有利于HUVEC與EPC之間的粘附,其中以5V/5Hz/6ms組粘附增強最為顯著； (4)雙相脈沖電刺激可上調(diào)HUVEC ICAM-1 mRNA相對表達量,變化規(guī)律與細胞間粘附實驗一致,同樣以5V/5Hz/6ms作用最顯著,提示HUVEC ICAM-1表達上調(diào)可能是電刺激促進HUVEC捕獲EPC的機制之一。 創(chuàng)新點 (1)前期研究中多采用直流電形式對HUVEC等血管內(nèi)皮細胞進行干預(yù),有關(guān)脈沖電刺激研究報道不多,本研究在國內(nèi)外較早采用正負雙相脈沖形式對HUVEC進行干預(yù),為電刺激下血管再生的體外研究提供新的實驗方法。 (2)本研究首次將內(nèi)皮祖細胞整合到電刺激調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能的研究中,明確了5V/5Hz/6ms雙相脈沖電刺激可增強HUVEC與EPC的粘附,為電刺激促進新生血管形成的研究提供新的理論依據(jù),國內(nèi)外尚未見同類型報道。 (3)本研究初步證實在5V/5Hz/6ms的雙向脈沖電刺激下,HUVEC捕獲EPC增多的機制與ICAM-1的表達上調(diào)有關(guān),再次肯定ICAM-1粘合識別對于EPC歸巢過程的重要性,也為其他防治手段下EPC的歸巢信號機制提供借鑒。
[Abstract]:Research background and purpose
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R33

【參考文獻】

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1 樂安;吳江;楊剛;余昶;黃華;陳槐卿;;不同幅值脈沖電刺激對內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的影響[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2008年04期

2 王前,鐘世鎮(zhèn),謝揚,張增坤;直流電刺激下組織培養(yǎng)液的電化學(xué)反應(yīng)[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;1994年02期

3 樂安;楊剛;吳江;賴怡;黃華;陳槐卿;;脈沖電刺激對內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的影響[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2008年03期

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本文編號：1346179