本文關(guān)鍵詞：RNAi抑制卡氏肺孢子TS基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 卡氏肺孢子 RNAi 表達(dá)載體 超微結(jié)構(gòu)

【摘要】： 在所有的真核、原核生物中,胸腺嘧啶核苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是一磷酸脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶。dTMP是一磷酸脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)的甲基化產(chǎn)物,在dTMP的合成過程,TS催化dUMP甲基化生成dTMP。5,10-二甲基四氫葉酸是這個(gè)反應(yīng)的甲基供體,它還是甲基反應(yīng)的電子供體,由此可見TS是DNA合成和修復(fù)必要的酶。 RNA干擾(RNA interfering,RNAi)是一種從低等生物到哺乳動(dòng)物的保守的防御反應(yīng)。雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被RNA酶Ⅲ(RNaseⅢ)酶切成約21-23nt的小片段干擾RNA(siRNA),進(jìn)而形成siRNA-蛋白復(fù)合物,即RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC通過識(shí)別降解具有同源序列的信使RNA(messenger ribonucleicacid,mRNA),最終導(dǎo)致特異性的基因表達(dá)沉默。本研究通過自行構(gòu)建能在大鼠卡氏肺孢子(pneumocystis carinii,PC)內(nèi)轉(zhuǎn)錄出功能性siRNA的載體,并將其用于干擾TS基因的表達(dá),為下一步基因功能和治療手段的研究奠定基礎(chǔ)。本研究共分為兩個(gè)部分。 一、大鼠卡氏肺孢子TS基因shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定方法:人工合成針對(duì)PC TS基因的1對(duì)shRNA序列并定向克隆到siRNA(small interference RNA)真核表達(dá)載體pTZU6+1上,采用雙酶切和測(cè)序法鑒定;結(jié)果:酶切和測(cè)序鑒定得到的產(chǎn)物與預(yù)期的目的基因一致;結(jié)論:成功構(gòu)建卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶靶向shRNA的真核表達(dá)載體。 二、RNAi抑制大鼠卡氏肺孢子TS基因的體外實(shí)驗(yàn)研究方法:連續(xù)地塞米松腹股溝皮下注射Wistar大鼠6周誘導(dǎo)建立卡氏肺孢子肺炎動(dòng)物模型;體外提取并純化PC,將含有GFP的pTZU6+1質(zhì)粒與Lipofectamine 2000分別按質(zhì)量與體積比2∶2、2∶4、2∶6、2∶8轉(zhuǎn)染至PC中,并分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)表達(dá)熒光的滋養(yǎng)體的數(shù)量;將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC,在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h分別計(jì)數(shù)每視野包囊均數(shù),轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過RT-PCR測(cè)定TS基因mRNA水平的表達(dá);并在轉(zhuǎn)染后48h取標(biāo)本作掃描電鏡,觀察重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組PC超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果:連續(xù)地塞米松皮下注射大鼠可誘導(dǎo)建立卡氏肺孢子肺炎動(dòng)物模型;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后綠色熒光蛋白表達(dá)數(shù)量最多;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后重組質(zhì)粒每視野包囊均數(shù)最少,且與空白組和空質(zhì)粒組有明顯差異;shRNA真核表達(dá)載體能有效抑制PC TS基因表達(dá),與轉(zhuǎn)染空載體組和空白組比較,TS基因mRNA表達(dá)減少至45.07%;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后PC表面出現(xiàn)損害主要為表面微絨毛脫落,殘存微絨毛水腫呈球型,有的PC包囊表面損害嚴(yán)重,出現(xiàn)大小不等的孔洞。結(jié)論:Lipofecttamine2000對(duì)重組質(zhì)粒有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)染效率;shRNA真核表達(dá)載體能有效抑制TS基因mRNA表達(dá),并且對(duì)PC超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度的破壞。
[Abstract]:Thymidylate synthase (TS) is a key enzyme in the synthesis of thymidine nucleotides (dTMP) in all eukaryotes and prokaryotes. DTMP is a methylation product of diphosphate deoxy uracil nucleotides (dUMP). In the synthesis process of dTMP, TS catalyzes the formation of dUMP methylation to produce dTMP. 5,10- two methylenetetrahydrofolate is the methyl donor of this reaction, and it is also the electron donor of the methyl reaction. This shows that TS is the necessary enzyme for the synthesis and repair of DNA.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346;R531.5

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