本文關鍵詞：RNAi抑制卡氏肺孢子TS基因表達的實驗研究　出處：《重慶醫(yī)科大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 卡氏肺孢子 RNAi 表達載體 超微結(jié)構(gòu)

【摘要】： 在所有的真核、原核生物中,胸腺嘧啶核苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是一磷酸脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)合成途徑的一個關鍵酶。dTMP是一磷酸脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)的甲基化產(chǎn)物,在dTMP的合成過程,TS催化dUMP甲基化生成dTMP。5,10-二甲基四氫葉酸是這個反應的甲基供體,它還是甲基反應的電子供體,由此可見TS是DNA合成和修復必要的酶。 RNA干擾(RNA interfering,RNAi)是一種從低等生物到哺乳動物的保守的防御反應。雙鏈RNA在細胞內(nèi)被RNA酶Ⅲ(RNaseⅢ)酶切成約21-23nt的小片段干擾RNA(siRNA),進而形成siRNA-蛋白復合物,即RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC通過識別降解具有同源序列的信使RNA(messenger ribonucleicacid,mRNA),最終導致特異性的基因表達沉默。本研究通過自行構(gòu)建能在大鼠卡氏肺孢子(pneumocystis carinii,PC)內(nèi)轉(zhuǎn)錄出功能性siRNA的載體,并將其用于干擾TS基因的表達,為下一步基因功能和治療手段的研究奠定基礎。本研究共分為兩個部分。 一、大鼠卡氏肺孢子TS基因shRNA真核表達載體的構(gòu)建與鑒定方法:人工合成針對PC TS基因的1對shRNA序列并定向克隆到siRNA(small interference RNA)真核表達載體pTZU6+1上,采用雙酶切和測序法鑒定;結(jié)果:酶切和測序鑒定得到的產(chǎn)物與預期的目的基因一致;結(jié)論:成功構(gòu)建卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶靶向shRNA的真核表達載體。 二、RNAi抑制大鼠卡氏肺孢子TS基因的體外實驗研究方法:連續(xù)地塞米松腹股溝皮下注射Wistar大鼠6周誘導建立卡氏肺孢子肺炎動物模型;體外提取并純化PC,將含有GFP的pTZU6+1質(zhì)粒與Lipofectamine 2000分別按質(zhì)量與體積比2∶2、2∶4、2∶6、2∶8轉(zhuǎn)染至PC中,并分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h在熒光顯微鏡下計數(shù)表達熒光的滋養(yǎng)體的數(shù)量;將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC,在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h分別計數(shù)每視野包囊均數(shù),轉(zhuǎn)染48小時后通過RT-PCR測定TS基因mRNA水平的表達;并在轉(zhuǎn)染后48h取標本作掃描電鏡,觀察重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對照組PC超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果:連續(xù)地塞米松皮下注射大鼠可誘導建立卡氏肺孢子肺炎動物模型;轉(zhuǎn)染48小時后綠色熒光蛋白表達數(shù)量最多;轉(zhuǎn)染48小時后重組質(zhì)粒每視野包囊均數(shù)最少,且與空白組和空質(zhì)粒組有明顯差異;shRNA真核表達載體能有效抑制PC TS基因表達,與轉(zhuǎn)染空載體組和空白組比較,TS基因mRNA表達減少至45.07%;轉(zhuǎn)染48小時后PC表面出現(xiàn)損害主要為表面微絨毛脫落,殘存微絨毛水腫呈球型,有的PC包囊表面損害嚴重,出現(xiàn)大小不等的孔洞。結(jié)論:Lipofecttamine2000對重組質(zhì)粒有較強的轉(zhuǎn)染效率;shRNA真核表達載體能有效抑制TS基因mRNA表達,并且對PC超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度的破壞。
[Abstract]:Thymidylate synthase (TS) is a key enzyme in the synthesis of thymidine nucleotides (dTMP) in all eukaryotes and prokaryotes. DTMP is a methylation product of diphosphate deoxy uracil nucleotides (dUMP). In the synthesis process of dTMP, TS catalyzes the formation of dUMP methylation to produce dTMP. 5,10- two methylenetetrahydrofolate is the methyl donor of this reaction, and it is also the electron donor of the methyl reaction. This shows that TS is the necessary enzyme for the synthesis and repair of DNA.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346;R531.5

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