本文關(guān)鍵詞：pTriEx-4neo載體多克隆位點的改造抗跨膜TNF-α單克隆抗體C1可變區(qū)基因測序及嵌合抗體的構(gòu)建　出處：《華中科技大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)對于某一基因的研究中,常常因為試驗?zāi)康暮驮囼炏到y(tǒng)的需要在不同的載體表達(dá)同一目的基因,如需要獲得大量高純度蛋白時往往要在有純化標(biāo)簽的原核或昆蟲表達(dá)載體中插入目的基因,而當(dāng)需要研究其在細(xì)胞內(nèi)部或表面的生物學(xué)功能時,又需要在真核表達(dá)載體中插入目的基因。而由于不同載體的多克隆位點迥異,若每更換一次載體,都需要從頭構(gòu)建,經(jīng)歷引物設(shè)計,在上下游引物中引入酶切位點,PCR擴增,酶切,連接,轉(zhuǎn)化,篩選和測序比對等諸多分子克隆操作,過程繁瑣復(fù)雜;且PCR擴增目的片段時,易出現(xiàn)堿基突變,導(dǎo)致分子克隆前功盡棄,需要重頭進行,嚴(yán)重延緩實驗進程。 為了解決這一問題,實現(xiàn)同一目的基因在多種不同載體間的快速切換,本課題組設(shè)計了系列載體的改造方案。其基本策略是:以pEGFP-C1的多克隆位點(multiple clone site,MCS)替換需改造系列質(zhì)粒的原有MCS。由于pEGFP-C1的MCS僅有不到100bp,如此短的片段酶切后純化回收困難,得率低,損失大,故在其EcoRI處,先插入一段238bp的無關(guān)輔助片段,再用此延長的MCS取代被改造載體的原有MCS,將延長的238bp的輔助片段切除后即構(gòu)建成功。本課題主要完成pTriEx-4 neo載體的改造工作。 1. pTriEx-4 neo/MCS-238重組體的構(gòu)建和克隆 以pEGFP-C1/238為模板,PCR擴增已加長238bp的pEGFP-C1的多克隆位點片段(命名為MCS-238),并在MCS-238片段的兩端分別引入EcoR V和Bsu36 I酶切位點。對MCS-238片段的PCR產(chǎn)物和pTriEx-4 neo載體分別進行EcoR V和Bsu36 I雙酶切,酶切回收PCR產(chǎn)物和載體,以T4 DNA連接酶進行連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,挑選陽性克隆。 2.陽性克隆的鑒定 驗證陽性克隆,結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR V和Bsu36 I雙酶切得到約320bp的目的片斷,與所連接的PCR片段大小一致。證明pTriEx-4 neo/MCS-238重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,已將pEGFP-C1/238載體的MCS-238成功置換入pTriEx-4 neo載體中。 3. 238bp延長片段的切除和pTriEx-4 neo/C1重組體的構(gòu)建 將pTriEx-4 neo/MCS-238重組體中的238bp延長輔助小片段經(jīng)EcoRI單酶切去除。連接轉(zhuǎn)化后通過菌落PCR初步鑒定后,經(jīng)DNA測序分析顯示改造后的pTriEx-4 neo載體中移植入的pEGFP-C1載體多克隆位點序列無突變,pTriEx-4 neo /C1載體構(gòu)建成功(C1代表pEGFP-C1的MCS)。 結(jié)論:本課題將pEGFP-C1的多克隆位點成功置換入pTriEx-4 neo載體中,替換其原有的MCS,完成部分本課題組的載體改造工程:即包括pTriEx-4 neo在內(nèi)的各種常用載體的多克隆位點的標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化。本工作為實現(xiàn)目的基因在pcDNA3.1(+),pTriEx-4 neo,pET-28a(+)和pEGFP-C1等各類本室常用載體之間方便快捷的轉(zhuǎn)移,為本課題組開展以分子克隆為基礎(chǔ)的各項科研提供了重要的實驗材料。 TNF-α(tumor necrosis factor,TNF-α)是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,在免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)中起著重要作用,控制著細(xì)胞分化、增殖與凋亡。在體內(nèi)以兩種形式存在:跨膜型(Transmembrane TNF-α, TM-TNF-α)和分泌型(Secreted-TNF-α,S-TNF-α)。TM- TNF-α是S-TNF-α的前體,比S-TNF-α多一段76個氨基酸組成的的信號肽。TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TACE)可在跨膜TNF-α的胞外結(jié)構(gòu)域切割TNF-α,釋放出S-TNF-α。兩型TNF-α具有不同的生物學(xué)功能,病理狀態(tài)下,炎癥病灶處S-TNF-α常常過量表達(dá),如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和Crohn’s病等自身免疫病,過量的S-TNF-α是該類疾病最顯著的癥狀之一,也是臨床治療干預(yù)的主要切入點。 本室的前期工作獲得了一株全新的抗跨膜TNF-α的單克隆抗體C1,它只能通過識別跨膜TNF-α的TACE酶切位點結(jié)合跨膜TNF-α,而對S-TNF-α無親和力。該株單抗的優(yōu)點是能選擇性結(jié)合跨膜TNF-α,通過空間位阻阻止TACE對于跨膜TNF-α的酶切,從而減少S-TNF-α的生成,而同時又不封閉TM-TNF-α的功能結(jié)構(gòu)域,因此具有獨特的抗炎作用方式。 鼠源性抗體無法直接應(yīng)用于人體,因此抗體的基因工程改造,如嵌合化和人源化是單抗用于人體試驗和治療的必經(jīng)之路,本課題的目的是克隆并測序得到鼠源母本C1單克隆抗體可變區(qū)基因序列,并初步構(gòu)建其人鼠嵌合抗體,為后續(xù)抗體人源化奠定基礎(chǔ)。 一.單克隆抗體C1輕鏈可變區(qū)基因的克隆與測序 選用家族特異性的鼠免疫球蛋白輕鏈先導(dǎo)肽簡并引物VL5’2與骨架四區(qū)簡并引物VL3’(JK1/2)配對,PCR成功擴增出390bp大小的單克隆抗體C1輕鏈可變區(qū)基因 目的條帶,對C1輕鏈可變區(qū)基因C1-VL5’2核苷酸序列進行測序,結(jié)果經(jīng)NCBI IgBLAST和IMGT V-quest等免疫球蛋白生物信息學(xué)工具分析得到V/J框內(nèi)重排的結(jié)果:即無終止密碼子出現(xiàn),確認(rèn)為有功能的輕鏈可變區(qū)重排序列。 二.單克隆抗體C1重鏈可變區(qū)基因的克隆與測序 選用家族特異性的鼠免疫球蛋白重鏈先導(dǎo)肽簡并引物VH5’1與骨架四區(qū)簡并引物VH3’(JH1/3)配對,PCR成功擴增出396bp大小的單克隆抗體C1重鏈可變區(qū)基因目的條帶,將C1重鏈可變區(qū)基因C1-VH5’1核苷酸序列測序結(jié)果經(jīng)NCBI IgBLAST和IMGT V-quest等免疫球蛋白生物信息學(xué)工具分析,得到V/D/J框內(nèi)重排的結(jié)果,即無終止密碼子出現(xiàn),確認(rèn)為有功能的重鏈可變區(qū)重排序列。 三. C1人鼠嵌合抗體pIRES表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá) 應(yīng)用重疊延伸PCR方法將C1輕鏈可變區(qū)基因與人kappa鏈恒定區(qū)基因融合構(gòu)建C1嵌合輕鏈基因,插入pIRES的多克隆位點A;將C1重鏈可變區(qū)基因與人gamma 1鏈恒定區(qū)基因融合構(gòu)建C1嵌合重鏈基因,插入pIRES的多克隆位點B。ELISA檢測轉(zhuǎn)染pIRES-C1表達(dá)載體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中的嵌合抗體表達(dá),得到陽性結(jié)果,提示嵌合抗體表達(dá)載體構(gòu)建成功,順利表達(dá)并分泌人鼠嵌合抗體。 結(jié)論:成功克隆抗跨膜TNF-?單克隆抗體C1輕鏈及重鏈可變區(qū)基因,經(jīng)序列分析證明為一對功能性免疫球蛋白可變區(qū)基因。利用重疊延伸PCR法成功構(gòu)建pIRES單啟動子雙順反子嵌合抗體表達(dá)載體,并在哺乳動物表達(dá)體系(CHO細(xì)胞)中表達(dá)嵌合抗體。
[Abstract]:In modern biomedical research for a gene, often because of the need to test purpose and test system in different expression vector of the same gene, such as the need to obtain a large number of high purity proteins tend to be inserted in a prokaryotic and insect expression vector purification tag gene, and when it is necessary to study in biology the function of internal or surface cells, and inserted into the vector of gene expression in eukaryotic. But due to the different vector multiple cloning sites are different, if each replacement of a carrier, need to build, through primer design, restriction sites in the primers by PCR amplification, enzyme digestion, connection, transformation, screening and sequencing comparison of many molecular cloning operation, process complex and PCR amplification; fragment, prone to mutation, resulting in molecular cloning come to naught, needs heavy, serious delay the progress of the experiment.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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