本文關(guān)鍵詞：瘦素對大鼠骨髓基質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化過程及IGF-1表達的影響　出處：《華北煤炭醫(yī)學(xué)院》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和細胞基質(zhì)構(gòu)成,其功能是傳導(dǎo)及分布載荷、維持和承受關(guān)節(jié)面的接觸應(yīng)力。關(guān)節(jié)軟骨是無血管、淋巴管和神經(jīng)的組織,所以自我修復(fù)能力相當(dāng)有限,輕微傷害就有可能導(dǎo)致漸進式的損傷。關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)是臨床上很棘手的問題。組織工程方法的出現(xiàn)給人們提供了可能最終解決問題的理想途徑。以往構(gòu)建的組織工程化軟骨多選用軟骨細胞作為種子細胞,存在著許多缺點:如供區(qū)功能障礙,獲得細胞量小,細胞在體外擴增過程中易發(fā)生去分化,而異體軟骨細胞存在著免疫原性及潛在攜帶病毒的可能性。而骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)作為軟骨細胞的前提細胞,來源易得,取材方便,增殖能力強,可在體外大規(guī)模擴增而不丟失多分化潛能,并且異體移植時排斥反應(yīng)小。它是一類具有多向分化潛能的干細胞,有自我復(fù)制、高度增殖和多向分化的能力,在特定培養(yǎng)條件下可向骨、軟骨、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、心肌、骨胳肌、脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞等間葉組織細胞轉(zhuǎn)化,故又將這些細胞稱為間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)。BMSCs向軟骨誘導(dǎo)分化的方法已較成熟,被認為是軟骨組織工程最有價值的種子細胞。 在體內(nèi)外向軟骨細胞分化增殖過程中常需要某些特定因子的作用,如TGF-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenet- ic protein, BMP)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)等。它們通過自分泌、旁分泌等方式,作用在BMSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化的各個階段。 IGF是一類結(jié)構(gòu)上類似于胰島素原的多肽,由骨、軟骨和其他多種組織合成,對多種組織和細胞起有絲分裂原作用。IGF能促進軟骨細胞分裂增殖,增強細胞功能,促進蛋白多糖及II型膠原的合成。Madry等研究表明IGF-1可促進BMSCs向軟骨細胞分化,還可抑制TGF-β1引起的細胞外焦磷酸鹽的積聚,防止焦磷酸鈣結(jié)晶的形成和進一步成骨,是TGF-β1重要的輔助因子。 臨床觀察顯示,成人血清瘦素水平與循環(huán)中的IGF-1呈顯著正相關(guān)。瘦素是一種由肥胖基因(ob)編碼、白色脂肪組織產(chǎn)生的低分子量多肽蛋白,參與調(diào)節(jié)能量代謝、食欲和生長發(fā)育。近年來,國內(nèi)外對瘦素的研究涉及多個領(lǐng)域,發(fā)現(xiàn)瘦素與多種疾病包括肥胖、糖尿病、高血壓、腎功能衰竭、骨質(zhì)疏松、乳腺癌等都有密切關(guān)系。Cornish等證實人類關(guān)節(jié)軟骨細胞上存在瘦素受體,瘦素還能促進羊和狗軟骨細胞的增殖,對成年小鼠全身應(yīng)用瘦素能增加骨骺生長板的厚度。將瘦素注入大鼠的膝關(guān)節(jié)后,可以刺激兩種軟骨生長因子,即IGF和TGF-β的表達,繼而增加蛋白多糖的合成。Maor等認為,在離體培養(yǎng)中,瘦素可通過直接作用于生長板軟骨細胞上的受體,來促進軟骨細胞前體細胞的增殖,增加下頜骨髁軟骨細胞的增殖和分化活性,其中,IGF-1通路可能起著重要的介導(dǎo)作用。故我們可以推測,瘦素可能通過IGF-1影響B(tài)MSCs的軟骨化過程,促進細胞外基質(zhì)的合成。目前關(guān)于瘦素對BMSCs的作用報道還較少,本實驗采用瘦素對體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs進行干預(yù),觀察細胞的增殖及細胞內(nèi)IGF-1以及細胞外基質(zhì)的表達情況,以了解瘦素對于體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs的作用及其機制,為臨床上瘦素參與軟骨損傷的修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。 目的 本課題旨在探討: 1.在體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs向軟骨細胞分化早期(72h),瘦素對大鼠BMSCs增殖的影響; 2.在基因水平測定不同濃度瘦素對BMSCs向軟骨細胞分化過程中IGF-1表達的影響; 3.瘦素作用于體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs向軟骨細胞分化過程中的最適效應(yīng)濃度。 綜合以上結(jié)果,探討瘦素在BMSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化中的影響及其作用機制,從而更好地指導(dǎo)臨床治療骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)及促進軟骨組織工程的發(fā)展。 方法 1采用體外細胞培養(yǎng)方法,選用4周齡SD大鼠的BMSCs作為實驗研究材料。 2對培養(yǎng)的大鼠BMSCs進行形態(tài)觀察。 3將培養(yǎng)的BMSCs傳代至3代,隨機分為6組,第1組為空白組,加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM, 5㳠胎牛血清,含重組人TGF-β1 10 ug/L,地塞米松10-7 mol/L ,維生素C 50μg/L),后5組為實驗組,分別加入含0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml瘦素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。 4用MTT法測定不同濃度瘦素作用于體外培養(yǎng)BMSCs的細胞增殖情況。 5采用免疫細胞化學(xué)法檢測不同濃度瘦素作用于體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs是否分泌II型膠原。 6采用PCR法檢測不同濃度瘦素作用于體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs表達IGF-1的情況。 7用SPSS15.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 1采用細胞體外培養(yǎng)方法成功培養(yǎng)BMSCs,并通過形態(tài)觀察得到證實。采用免疫細胞化學(xué)法證明轉(zhuǎn)化后的細胞為軟骨細胞。 2在前24h,各實驗組細胞的增殖情況均與對照組有顯著差異(P0.05);在48h~72h,加入10 ng/ml濃度瘦素的實驗組OD值明顯增高,與其他各組均有顯著差異(P0.05)。 3經(jīng)瘦素刺激的各實驗組定向誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs表達IGF-1具有不同程度的增加,最大效應(yīng)濃度為10ng/ml,而高濃度的瘦素的促進作用并不明顯。 結(jié)論 1瘦素在BMSCs向軟骨細胞分化早期可以促進細胞增殖。 2瘦素可通過提高BMSCs中IGF-1的表達,對BMSCs向軟骨細胞定向分化起到促進作用。
[Abstract]:Articular cartilage is mainly composed of chondrocytes and cell matrix, which function to transmit and distribute load, maintain and bear the contact stress of articular surface. Articular cartilage is a vascular, lymphatic, and nerve tissue, so the ability to repair itself is quite limited and slight injury may lead to progressive injury. The repair of articular cartilage defect is a difficult problem in clinical. The emergence of organizational engineering methods provides an ideal way for people to eventually solve the problem. The construction of tissue engineered cartilage with cartilage cells as seed cells, there are many shortcomings such as: for cell dysfunction, a small amount of cells during in vitro expansion easy to differentiate, and allogeneic chondrocytes exist the possibility of immunogenicity and potential virus. Bone marrow stromal cells (BMSCs), as the prerequisite cell of chondrocytes, is easy to obtain, easy to obtain and proliferative, and can be amplified in large scale without losing the potential of multiple differentiation. It is a kind of pluripotent stem cells, capable of self replication, highly proliferation and differentiation, in specific culture conditions can be transformed into bone, cartilage, glial cells, myocardium, skeletal muscle, adipose cells, vascular endothelial cells and mesenchymal cells, so it is also called these cells mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cell, MSC). The method of inducing differentiation of BMSCs into cartilage is more mature, and is considered to be the most valuable seed cell of cartilage tissue engineering.
【學(xué)位授予單位】：華北煤炭醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：1345078