本文關(guān)鍵詞：AMPK,CaMKⅡ和PKC在鈣信號(hào)調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞GLUT4胞吞和胞吐機(jī)制中的作用　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 本課題組前期發(fā)現(xiàn)鈣離子載體Ionomycin升高骨骼肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)運(yùn)輸促進(jìn)葡萄糖吸收,ionomycin促進(jìn)GLUT4胞吐并抑制GLUT4胞吞,為明確詳細(xì)的信號(hào)機(jī)制,本課題探討AMPK、CaMKII和PKC在ionomycin調(diào)節(jié)GLUT4胞吞和胞吐機(jī)制中的作用。 方法： 用終濃度為1μM的ionomycin孵育穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GLUT4myc的L6-GLUT4myc骨骼肌肌細(xì)胞,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞膜表面GLUT4myc水平,western blot方法檢測(cè)不同蛋白的磷酸化水平、蛋白表達(dá)水平以及各種化學(xué)性蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白磷酸化的影響。siRNA技術(shù)下調(diào)目的蛋白表達(dá)水平,研究5'-AMP激活蛋白激酶(AMPK)、依賴鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶Ⅱ(calmoduling-dependent protein kinase II, CaMKII)是否參與ionomycin調(diào)節(jié)的GLUT4myc胞吞和胞吐作用。采用傳統(tǒng)型和新穎型PKC抑制劑G66983和傳統(tǒng)型PKC抑制劑G66976抑制PKC活性,檢測(cè)PKC是否參與ionomycin調(diào)節(jié)的GLUT4運(yùn)輸。結(jié)果： 1μM鈣離子載體ionomycin孵育L6-GLUT4myc骨骼肌肌細(xì)胞5分鐘和10分鐘,磷酸化CaMKII、AMPK和蛋白激酶C (PKCs),但不影響蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)。用siRNA下調(diào)CaMKIIδ的表達(dá),抑制了ionomycin對(duì)GLUT4myc胞吐的調(diào)節(jié)作用,但不影響其對(duì)胞吞的作用,由此抑制了細(xì)胞表面GLUT4myc數(shù)量的增加。應(yīng)用AMPK小分子抑制劑Compound C,不影響ionomycin抑制的GLUT4myc胞吞作用。應(yīng)用CaMKK抑制劑STO-609,抑制了ionomycin刺激增加的GLUT4myc胞吐但不影響其對(duì)胞吞的抑制作用,由此降低了ionomycin增加細(xì)胞表面GLUT4myc的作用。傳統(tǒng)型和新穎型PKC抑制劑G66983,抑制了ionomycin升高細(xì)胞表面GLUT4myc的作用,并抑制ionomycin對(duì)PKC底物的磷酸化作用。 siRNA下調(diào)CaMKIIδ的表達(dá),抑制了ionomycin對(duì)CaMKII T286的磷酸化作用,但不抑制ionomycin對(duì)AMPKT172的磷酸化作用。siRNA下調(diào)AMPK的表達(dá),抑制了ionomycin對(duì)AMPKT172的磷酸化作用,但不降低ionomycin對(duì)CaMKII T286磷酸化的作用倍數(shù)。CaMKK抑制劑ST0609,抑制對(duì)照組對(duì)CaMKⅡ T286的磷酸化作用,但不抑制ionomycin對(duì)CaMKⅡ T286磷酸化的作用倍數(shù)。PKC抑制劑Go6976(傳統(tǒng)型)和Go6983(傳統(tǒng)型和新穎型)不影響ionomycin對(duì)AMPK和CaMKⅡ的磷酸化作用。 結(jié)論： 1. Ionomycin升高AMPK、CaMKⅡ和PKC底物磷酸化水平。 2. CaMⅡδ參與ionomycin促進(jìn)GLUT4myc胞吐的作用。 3. AMPK和CaMⅡδ不參與ionomycin抑制GLUT4myc胞吞的作用。 4.傳統(tǒng)型或新穎型PKC參與ionomycin調(diào)節(jié)的GLUT4myc運(yùn)輸。 5.下調(diào)CaMKⅡS的表達(dá),不影響ionomycin對(duì)AMPK的磷酸化作用。 6.下調(diào)AMPK的表達(dá)或ST0609,不影響ionmycin對(duì)CaMKⅡ的磷酸化作用。 7.抑制PKC不影響ionomycin對(duì)CaMKⅡ和AMPK的磷酸化作用。 這些結(jié)果證明了鈣信號(hào)有選擇地調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞GLUT4myc胞吐和胞吞。
[Abstract]:Objective:
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭麗;徐濤;;糖尿病研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年07期

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本文編號(hào)：1345143