發(fā)布時(shí)間：2017-12-27 23:16

  本文關(guān)鍵詞：角質(zhì)細(xì)胞特異性Pten基因敲除導(dǎo)致小鼠毛囊干細(xì)胞動(dòng)員加快　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： PTEN 毛囊干細(xì)胞 生長(zhǎng)期 干細(xì)胞動(dòng)員

【摘要】： 毛囊干細(xì)胞位于毛囊隆突內(nèi),是維持成體皮膚穩(wěn)態(tài)和毛發(fā)再生的重要基礎(chǔ)。毛囊干細(xì)胞自我更新和分化之間平衡的保持是毛囊干細(xì)胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵。兩者間平衡的破壞會(huì)引起皮膚腫瘤或者干細(xì)胞耗竭的發(fā)生。WNT/β-catenin和BMP信號(hào)通路在毛囊干細(xì)胞分化和動(dòng)員過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PTEN(10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物)通過(guò)使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化,抑制PI3K/AKT信號(hào)通路多個(gè)信號(hào)分子的活化。其中最重要的一個(gè)效應(yīng)分子是AKT,AKT的活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期加快,細(xì)胞凋亡抑制以及蛋白翻譯增加等。在其它組織干細(xì)胞中的研究表明,Pten基因?qū)Χ喾N干細(xì)胞的維持非常重要,但Pten基因是否在毛囊干細(xì)胞動(dòng)員和維持中發(fā)揮作用,卻未見相關(guān)報(bào)道。 我們通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn),PTEN在表皮角質(zhì)細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞中表達(dá),提示PTEN可能在毛囊干細(xì)胞動(dòng)員和維持中發(fā)揮作用。我們以前的研究證實(shí),角蛋白5(K5)的啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)Cre重組酶在小鼠毛囊干細(xì)胞中成功表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn),該轉(zhuǎn)基因小鼠能在小鼠的整個(gè)表皮和毛囊中剔除Pten基因。我們通過(guò)檢測(cè)AKT磷酸化的水平,發(fā)現(xiàn)在Pten基因敲除小鼠的表皮和包括隆突在內(nèi)的整個(gè)毛囊中AKT磷酸化水平顯著升高。Pten基因敲除小鼠毛囊生長(zhǎng)期提前,靜息期縮短,毛囊周期加快,同時(shí)表皮顯著增厚,角質(zhì)細(xì)胞增殖增加。短期核苷酸類似物BrdU(bromodeoxyuridine)標(biāo)記滯留實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝻@示出表皮和毛囊增殖旺盛的區(qū)域。給出生后23天小鼠,連續(xù)3天分3次腹腔注射BrdU,滯留34天后檢測(cè)BrdU信號(hào)。結(jié)果表明在毛囊峽部和表皮基底層等細(xì)胞增殖比較旺盛的部分,Pten基因敲除小鼠的標(biāo)記滯留細(xì)胞顯著減少。 為研究Pten基因敲除對(duì)毛囊干細(xì)胞數(shù)量的影響,我們檢測(cè)了兩種常用的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記分子K15和CD34在對(duì)照和Pten基因敲除小鼠靜息期毛囊中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pten基因敲除小鼠與對(duì)照小鼠相比,每個(gè)靜息期毛囊中CD34和K15表達(dá)沒(méi)有發(fā)生顯著改變。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照小鼠相比,Pten基因敲除小鼠毛囊干細(xì)胞在表皮所有角質(zhì)細(xì)胞中的比例下降(8.74%±1% vs 6.78±0.7%,p0.01, n=3)。流式細(xì)胞術(shù)與原位檢測(cè)之間產(chǎn)生差異的主要原因是Pten基因敲除小鼠表皮增厚,角質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,因此毛囊干細(xì)胞的比例會(huì)下降。 利用干細(xì)胞細(xì)胞周期比其子代細(xì)胞周期緩慢的原理,我們利用長(zhǎng)程BrdU標(biāo)記滯留實(shí)驗(yàn)檢測(cè)毛囊干細(xì)胞。具體做法是給出生后10天小鼠連續(xù)2天分4次腹腔注射BrdU,60-77天后通過(guò)免疫組化檢測(cè)BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞。被摻入BrdU的終末分化細(xì)胞會(huì)從皮膚表面脫落,具有較強(qiáng)增殖能力的臨時(shí)增殖細(xì)胞其摻入核內(nèi)的BrdU會(huì)因?yàn)榉磸?fù)增殖而被逐漸稀釋,最終呈現(xiàn)BrdU陽(yáng)性的細(xì)胞則是細(xì)胞周期緩慢的毛囊干細(xì)胞。注射60天后檢測(cè)BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在對(duì)照和Pten基因敲除小鼠的毛囊隆突都能存在很多BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞。而注射77天后再次檢測(cè)BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞,結(jié)果顯示在對(duì)照小鼠的毛囊隆突存在BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞,而Pten基因敲除小鼠的毛囊和整個(gè)表皮的細(xì)胞中都基本檢測(cè)不到BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞。說(shuō)明Pten基因敲除會(huì)促進(jìn)毛囊干細(xì)胞動(dòng)員。利用CD34和Ki67抗體熒光雙標(biāo)記檢測(cè),發(fā)現(xiàn)對(duì)照小鼠毛囊中表達(dá)CD34的細(xì)胞基本不表達(dá)Ki67,而Pten基因敲除小鼠毛囊CD34陽(yáng)性的細(xì)胞其中一些是Ki67陽(yáng)性的。這就直接證明了Pten基因敲除后小鼠毛囊干細(xì)胞動(dòng)員確實(shí)加快。 我們利用干細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)在體外進(jìn)一步證明了Pten基因敲除小鼠的毛囊干細(xì)胞動(dòng)員加快。將Pten基因敲除小鼠和對(duì)照小鼠皮膚中原代分離的相同數(shù)目的角質(zhì)細(xì)胞在有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞做滋養(yǎng)層的體系中培養(yǎng),對(duì)克隆形成的速度和大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。發(fā)現(xiàn)來(lái)自Pten基因敲除小鼠的細(xì)胞克隆形成速度快,但小克隆較多。其中細(xì)胞數(shù)在32-200的小克隆約占全部克隆的63%,而對(duì)照小鼠是41%。細(xì)胞數(shù)大于1000的大克隆只占全部克隆的1.37%,而對(duì)照小鼠是18%。Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示Pten基因敲除角質(zhì)細(xì)胞形成的大克隆中細(xì)胞增殖能力顯著下降。這些數(shù)據(jù)一定程度上說(shuō)明在一個(gè)干細(xì)胞自我更新不能維持的體系中,Pten基因敲除的表皮干細(xì)胞會(huì)由于動(dòng)員加快而迅速失去分化的潛能。 綜上所述,我們首次證明Pten基因缺失將導(dǎo)致小鼠毛囊干細(xì)胞動(dòng)員加快,而對(duì)毛囊干細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有顯著影響。
[Abstract]:Hair follicle stem cells are located in the protuberance of the hair follicle, which is an important basis for maintaining the homeostasis of the adult skin and the regeneration of hair. The balance between self renewal and differentiation of hair follicle stem cells is the key to the function of hair follicle stem cells. The destruction of the balance between the two causes the occurrence of skin tumors or stem cell exhaustion. WNT/ beta -catenin and BMP signaling pathways play an important role in the differentiation and mobilization of hair follicle stem cells. PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) dephosphorylation of 3,4,5- three phosphatidylinositol (PIP3) and inhibit the activation of multiple signal molecules in PI3K/AKT signaling pathway. One of the most important effector molecules is AKT. The activation of AKT leads to the accelerated cell cycle, the inhibition of cell apoptosis and the increase of protein translation. Studies in other tissue stem cells show that Pten gene is very important for the maintenance of many kinds of stem cells, but whether Pten gene plays a role in the mobilization and maintenance of hair follicle stem cells has not been reported.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1343599