本文關(guān)鍵詞：角質(zhì)細胞特異性Pten基因敲除導(dǎo)致小鼠毛囊干細胞動員加快　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 毛囊干細胞位于毛囊隆突內(nèi),是維持成體皮膚穩(wěn)態(tài)和毛發(fā)再生的重要基礎(chǔ)。毛囊干細胞自我更新和分化之間平衡的保持是毛囊干細胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵。兩者間平衡的破壞會引起皮膚腫瘤或者干細胞耗竭的發(fā)生。WNT/β-catenin和BMP信號通路在毛囊干細胞分化和動員過程中發(fā)揮重要作用。PTEN(10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物)通過使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化,抑制PI3K/AKT信號通路多個信號分子的活化。其中最重要的一個效應(yīng)分子是AKT,AKT的活化會導(dǎo)致細胞周期加快,細胞凋亡抑制以及蛋白翻譯增加等。在其它組織干細胞中的研究表明,Pten基因?qū)Χ喾N干細胞的維持非常重要,但Pten基因是否在毛囊干細胞動員和維持中發(fā)揮作用,卻未見相關(guān)報道。 我們通過免疫組化發(fā)現(xiàn),PTEN在表皮角質(zhì)細胞和毛囊干細胞中表達,提示PTEN可能在毛囊干細胞動員和維持中發(fā)揮作用。我們以前的研究證實,角蛋白5(K5)的啟動子能夠指導(dǎo)Cre重組酶在小鼠毛囊干細胞中成功表達。本研究中發(fā)現(xiàn),該轉(zhuǎn)基因小鼠能在小鼠的整個表皮和毛囊中剔除Pten基因。我們通過檢測AKT磷酸化的水平,發(fā)現(xiàn)在Pten基因敲除小鼠的表皮和包括隆突在內(nèi)的整個毛囊中AKT磷酸化水平顯著升高。Pten基因敲除小鼠毛囊生長期提前,靜息期縮短,毛囊周期加快,同時表皮顯著增厚,角質(zhì)細胞增殖增加。短期核苷酸類似物BrdU(bromodeoxyuridine)標記滯留實驗?zāi)軌蝻@示出表皮和毛囊增殖旺盛的區(qū)域。給出生后23天小鼠,連續(xù)3天分3次腹腔注射BrdU,滯留34天后檢測BrdU信號。結(jié)果表明在毛囊峽部和表皮基底層等細胞增殖比較旺盛的部分,Pten基因敲除小鼠的標記滯留細胞顯著減少。 為研究Pten基因敲除對毛囊干細胞數(shù)量的影響,我們檢測了兩種常用的毛囊干細胞標記分子K15和CD34在對照和Pten基因敲除小鼠靜息期毛囊中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pten基因敲除小鼠與對照小鼠相比,每個靜息期毛囊中CD34和K15表達沒有發(fā)生顯著改變。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),與對照小鼠相比,Pten基因敲除小鼠毛囊干細胞在表皮所有角質(zhì)細胞中的比例下降(8.74%±1% vs 6.78±0.7%,p0.01, n=3)。流式細胞術(shù)與原位檢測之間產(chǎn)生差異的主要原因是Pten基因敲除小鼠表皮增厚,角質(zhì)細胞數(shù)量增加,因此毛囊干細胞的比例會下降。 利用干細胞細胞周期比其子代細胞周期緩慢的原理,我們利用長程BrdU標記滯留實驗檢測毛囊干細胞。具體做法是給出生后10天小鼠連續(xù)2天分4次腹腔注射BrdU,60-77天后通過免疫組化檢測BrdU標記滯留細胞。被摻入BrdU的終末分化細胞會從皮膚表面脫落,具有較強增殖能力的臨時增殖細胞其摻入核內(nèi)的BrdU會因為反復(fù)增殖而被逐漸稀釋,最終呈現(xiàn)BrdU陽性的細胞則是細胞周期緩慢的毛囊干細胞。注射60天后檢測BrdU標記滯留細胞,發(fā)現(xiàn)在對照和Pten基因敲除小鼠的毛囊隆突都能存在很多BrdU標記滯留細胞。而注射77天后再次檢測BrdU標記滯留細胞,結(jié)果顯示在對照小鼠的毛囊隆突存在BrdU標記滯留細胞,而Pten基因敲除小鼠的毛囊和整個表皮的細胞中都基本檢測不到BrdU標記滯留細胞。說明Pten基因敲除會促進毛囊干細胞動員。利用CD34和Ki67抗體熒光雙標記檢測,發(fā)現(xiàn)對照小鼠毛囊中表達CD34的細胞基本不表達Ki67,而Pten基因敲除小鼠毛囊CD34陽性的細胞其中一些是Ki67陽性的。這就直接證明了Pten基因敲除后小鼠毛囊干細胞動員確實加快。 我們利用干細胞克隆形成實驗在體外進一步證明了Pten基因敲除小鼠的毛囊干細胞動員加快。將Pten基因敲除小鼠和對照小鼠皮膚中原代分離的相同數(shù)目的角質(zhì)細胞在有小鼠胚胎成纖維細胞做滋養(yǎng)層的體系中培養(yǎng),對克隆形成的速度和大小進行統(tǒng)計和分析。發(fā)現(xiàn)來自Pten基因敲除小鼠的細胞克隆形成速度快,但小克隆較多。其中細胞數(shù)在32-200的小克隆約占全部克隆的63%,而對照小鼠是41%。細胞數(shù)大于1000的大克隆只占全部克隆的1.37%,而對照小鼠是18%。Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示Pten基因敲除角質(zhì)細胞形成的大克隆中細胞增殖能力顯著下降。這些數(shù)據(jù)一定程度上說明在一個干細胞自我更新不能維持的體系中,Pten基因敲除的表皮干細胞會由于動員加快而迅速失去分化的潛能。 綜上所述,我們首次證明Pten基因缺失將導(dǎo)致小鼠毛囊干細胞動員加快,而對毛囊干細胞的數(shù)量沒有顯著影響。
[Abstract]:Hair follicle stem cells are located in the protuberance of the hair follicle, which is an important basis for maintaining the homeostasis of the adult skin and the regeneration of hair. The balance between self renewal and differentiation of hair follicle stem cells is the key to the function of hair follicle stem cells. The destruction of the balance between the two causes the occurrence of skin tumors or stem cell exhaustion. WNT/ beta -catenin and BMP signaling pathways play an important role in the differentiation and mobilization of hair follicle stem cells. PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) dephosphorylation of 3,4,5- three phosphatidylinositol (PIP3) and inhibit the activation of multiple signal molecules in PI3K/AKT signaling pathway. One of the most important effector molecules is AKT. The activation of AKT leads to the accelerated cell cycle, the inhibition of cell apoptosis and the increase of protein translation. Studies in other tissue stem cells show that Pten gene is very important for the maintenance of many kinds of stem cells, but whether Pten gene plays a role in the mobilization and maintenance of hair follicle stem cells has not been reported.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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