發(fā)布時間：2017-12-27 23:01

  本文關(guān)鍵詞：兔傳代骨髓間充質(zhì)干細胞的篩選及其成骨能力的研究　出處：《桂林醫(yī)學(xué)院》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：1.本研究從兔骨髓液中分離骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），進行體外培養(yǎng)，旨在建立一套行之有效的體外分離，培養(yǎng)BMSCs的方法。2.通過各代觀察BMSCs的形態(tài)，檢測不同代BMSCs的細胞增殖周期和細胞生長周期，從而了解各代BMSCs的生物學(xué)性狀以及初步確定作為理想的組織工程種子細胞的理想代數(shù)。3.BMSCs在成骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下向成骨細胞特定分化，通過檢測成骨細胞特有指標(biāo)Ⅰ型膠原，，堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)的表達，了解BMSCs向成骨細胞方向分化的能力。方法：1.利用骨穿針在兔股骨抽取骨髓液，利用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁細胞篩選法對BMSCs進行體外培養(yǎng)，觀察細胞的生長情況。2.觀察各代細胞形態(tài)并且測定各代細胞的增殖周期和細胞生長周期，了解各代細胞的生物學(xué)性狀。3.在體外利用成骨誘導(dǎo)液（完全培養(yǎng)基中加入地塞米松濃度為10-8mol/L、β-磷酸甘油鈉10mmol/L、維生素C50ug/ml），在誘導(dǎo)的第7天，第14天和第21天分別檢測Ⅰ型膠原，堿性磷酸酶（ALP）,鈣結(jié)節(jié)表達。研究BMSCs向成骨細胞分化的能力。結(jié)果：1.利用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法分離出了大量具有活性的BMSCs。接種48小時后觀察，見少量細胞呈長梭性，大部分為短梭形和多邊形。接種72小時觀察，貼壁細胞明顯增多，呈長梭形。接種第5天，細胞增殖明顯，并且可見若干細胞團落形成。接種第7天，達到融合。2.第1，5，10代細胞經(jīng)MTT和流式細胞儀檢測，第1代和第5代的增殖能力和生長周期無顯著性差異（P0.05），第10代細胞與第1代細胞，第5代細胞之間的增殖能力和細胞生長周期較前兩代有明顯的差別（P0.05）。3．BMSCs向成骨方向分化：貼壁細胞隨著時間的延長，由最初的長梭狀，逐漸向多角形發(fā)展。誘導(dǎo)組細胞呈現(xiàn)接觸性抑制，正常組呈現(xiàn)重疊性生長。Ⅰ型膠原染色顯示誘導(dǎo)組細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色，正常組胞質(zhì)未染色。ALP酶標(biāo)法顯示誘導(dǎo)組較正常組的含量明顯增加（P0.05）。誘導(dǎo)組鈣結(jié)節(jié)染色呈紅色，正常組未染色。顯示BMSCs在特定條件下可以很好的向成骨細胞分化。結(jié)論：1.通過利用密度梯度離心法聯(lián)合貼別篩選法可以獲得較高純度和活性的BMSCs。2.通過對各代BMSCs形態(tài)學(xué)的觀查，細胞增殖周期和細胞生長周期的檢測，證實第1，5代細胞之間的生物學(xué)特性無明顯的區(qū)別，第10代細胞增值減慢，處于非分裂期的細胞明顯增多，與第1，5代細胞之間有明顯的差別，且第5細胞已成為單一細胞系，所以確立第5代細胞可以成為組織工程中提供良好的種子細胞。3.通過利用成骨誘導(dǎo)液對BMSCs向成骨細胞誘導(dǎo)，并對成骨細胞特定指標(biāo)Ⅰ型膠原，ALP,鈣結(jié)節(jié)檢測的結(jié)果顯示，第5代BMSCs在含有成骨誘導(dǎo)液條件下可以向成骨細胞分化，并且具有很強的分化能力。
[Abstract]:Objective: 1.. In this study, bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated from rabbit bone marrow and cultured in vitro. The aim was to establish an effective method for isolating and culturing BMSCs in vitro. 2., we can observe the morphology of BMSCs through various generations, detect cell proliferation cycle and cell growth cycle of different generations of BMSCs, so as to understand the biological characteristics of each generation of BMSCs and preliminarily determine the ideal algebra as an ideal tissue engineering seed cell. 3.BMSCs differentiated into osteoblasts under the induction of osteogenic induction. By detecting the expression of type I collagen, alkaline phosphatase and calcium nodules in osteoblasts, we could understand the ability of BMSCs to differentiate into osteoblasts. Methods: 1. using bone needle in rabbit femoral bone marrow, using density gradient centrifugation and adherent cells were cultured in vitro screening method of BMSCs, observe the cell growth. 2. observe the cell morphology of each generation and determine the cycle of cell proliferation and cell growth cycle, and understand the biological characters of each generation. 3. in vitro using osteogenic medium (complete medium with dexamethasone concentration 10-8mol/L, beta glycerophosphate sodium 10mmol/L, vitamin C50ug/ml), on the seventh day of induction, fourteenth days and twenty-first days respectively, type I collagen, alkaline phosphatase (ALP), the expression of calcium nodules. To study the ability of BMSCs to differentiate into osteoblasts. Results: 1. a large number of active BMSCs were separated by the combination of density gradient centrifugation and wall screening. After 48 hours of inoculation, a small number of cells were found to be spindle, most of which were short shuttle and polygon. After 72 hours of inoculation, the adherent cells were significantly increased, showing a long spindle shape. After fifth days of inoculation, the cell proliferation was obvious, and a number of cell clusters were formed. Inoculation for seventh days to achieve fusion. 2., first, 5, 10 generation cells by MTT and flow cytometry, no significant difference between the first and fifth generation of proliferation and growth cycle (P0.05), the tenth generation of cells and cells of the first generation, fifth generation of cell proliferation and cell cycle compared with the previous two generations have obvious difference (P0.05). 3.BMSCs differentiated into osteogenic direction: the adherent cells developed from the initial long spindle shape to polygon with the prolongation of time. The cells in the induced group showed contact inhibition, and the normal group showed overlapping growth. Type I collagen staining showed that the cytoplasm of the induced group showed brown yellow, and the normal cytoplasm was not stained. The ALP enzyme labeling method showed that the content of the induced group was significantly higher than that in the normal group (P0.05). The coloring of calcium nodules in the induced group was red, and the normal group was not stained. It is shown that BMSCs can be well differentiated into osteoblasts under specific conditions. Conclusion: 1. the high purity and activity of BMSCs can be obtained by the combination of density gradient centrifugation and the combination screening method. Based on the 2. generation BMSCs morphological observation, detection, cell cycle and cell growth cycle was confirmed in first, no significant difference between the biological characteristics of cells of the 5 generation, tenth generation cell proliferation slowed in nondividing cells increased significantly, and the first, there were significant differences between the 5 generation cells, and fifth cells have become single cells, so the establishment of the fifth generation cells can be provided good seed cells in tissue engineering. 3. through the use of osteogenic medium on BMSCs osteogenic induction, and osteoblast specific index of collagen, ALP, calcium nodules detection results showed that the fifth generation BMSCs can differentiate into osteoblast in osteogenic medium containing conditions, and has a strong ability of differentiation.
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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本文編號：1343527