本文關(guān)鍵詞：miR-34通過(guò)自噬作用調(diào)控衰老的機(jī)制研究　出處：《中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 微小RNA (microRNA, miRNA)是一類功能高度保守的非編碼單鏈小分子RNA,通過(guò)與靶基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)多個(gè)靶mRNAs的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。近年來(lái)研究表明,miRNA與發(fā)育、衰老、免疫和腫瘤等病理生理過(guò)程密切相關(guān)。在大鼠和線蟲(chóng)microRNA芯片的研究中發(fā)現(xiàn)miR-34隨增齡表達(dá)上調(diào),體外研究也證實(shí)miR-34能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期等途徑加速細(xì)胞衰老的進(jìn)程。自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體對(duì)自身受損結(jié)構(gòu)的吞噬降解過(guò)程,對(duì)自噬作用的調(diào)控是p53、SIRT1等衰老相關(guān)基因調(diào)控壽命的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已有研究顯示miR-34參與p53和SIRT1的信號(hào)通路,提示自噬可能是miR-34參與衰老調(diào)控的重要機(jī)制。本研究旨在通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明miR-34在衰老進(jìn)程中的確切作用及自噬在介導(dǎo)miR-34調(diào)控衰老作用中的分子機(jī)制。全文共分三個(gè)部分： 第一部分：miR-34對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響 通過(guò)real-time RT-PCR檢測(cè)大鼠和線蟲(chóng)miR-34隨增齡的表達(dá)變化特點(diǎn)；并觀察miR-34缺失突變對(duì)線蟲(chóng)壽命及應(yīng)激耐受性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與3月齡大鼠相比,24月齡wistar大鼠心臟、腦組織、肝臟、胸主動(dòng)脈和腎臟miR-34a的表達(dá)分別增高2.36、1.71、1.85、3.45和2.14倍(p0.05-0.01)。與1d線蟲(chóng)成蟲(chóng)相比,7d、9d和13d野生型N2株線蟲(chóng)成蟲(chóng)miR-34的表達(dá)顯著增高(p0.05-0.01)。相關(guān)分析顯示,N2株線蟲(chóng)miR-34的表達(dá)與增齡呈顯著正相關(guān)(r=0.856, p0.0001).線蟲(chóng)壽命分析結(jié)果顯示,miR-34缺失突變能延緩線蟲(chóng)的衰老進(jìn)程,使線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)42%-62%(p0.0001),并能改善線蟲(chóng)對(duì)熱休克和氧化應(yīng)激的耐受性。同時(shí)發(fā)現(xiàn),間斷禁食能使野生型N2株線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)37%(p0.0001),但不影響miR-34缺失突變株線蟲(chóng)的壽命。本部分研究結(jié)果顯示,miR-34能夠調(diào)控線蟲(chóng)的衰老進(jìn)程,并提示其機(jī)制可能與限食、應(yīng)激等共同的機(jī)制--自噬作用有關(guān)。 第二部分：自噬在介導(dǎo)miR-34調(diào)控衰老中的作用研究 利用RNAi敲除自噬相關(guān)基因,觀察抑制自噬對(duì)miR-34缺失突變株線蟲(chóng)壽命的影響；并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a(人miR-34主要轉(zhuǎn)錄本之一)對(duì)自噬的調(diào)控作用及SIRT1對(duì)該作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在野生型N2株線蟲(chóng),自噬基因RNAi組和對(duì)照質(zhì)粒組之間的壽命無(wú)顯著差異；而miR-34缺失突變株線蟲(chóng)各RNAi組的壽命較對(duì)照質(zhì)粒組顯著縮短(p0.0001)。體外實(shí)驗(yàn)顯示,miR-34a能抑制細(xì)胞自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3II的表達(dá)(p0.05)。與對(duì)照組相比,SIRT1 siRNA組LC3II的表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05),但SIRT1 siRNA和miR-34a inhibitor共轉(zhuǎn)染組LC3II的表達(dá)仍顯著升高(p0.05)。本部分研究結(jié)果揭示,miR-34通過(guò)抑制細(xì)胞的自噬作用而調(diào)控衰老,且該作用不完全依賴SIRT1,提示自噬是miR-34調(diào)控衰老的重要機(jī)制。 第三部分：miR-34通過(guò)Atg4B和Atg9A調(diào)控自噬的機(jī)制研究 利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-34a可能的靶基因；通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-34a對(duì)靶基因表達(dá)的影響；進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-34a與靶基因3'-UTR序列的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-34a共有2904個(gè)可能的靶基因,其中Atg4B和Atg9A直接參與自噬體的形成過(guò)程。體外實(shí)驗(yàn)顯示,miR-34a能下調(diào)Atg4B和Atg9A蛋白的表達(dá)(p0.05-0.01),但不影響其mRNA的表達(dá)水平。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-34a能通過(guò)與Atg4B和Atg9A基因3'-UTR序列靶結(jié)合位點(diǎn)的相互作用,下調(diào)熒光素酶活性(p0.05-0.01)。本部分研究結(jié)果證實(shí),miR-34a能夠在轉(zhuǎn)錄后水平直接抑制Atg4B和Atg9A蛋白的表達(dá),從而調(diào)控自噬作用。 綜上所述,本研究從整體動(dòng)物水平驗(yàn)證了miR-34能夠促進(jìn)衰老進(jìn)程,而自噬是介導(dǎo)miR-34調(diào)控衰老作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-34a能夠在轉(zhuǎn)錄后水平直接抑制自噬相關(guān)蛋白Atg4B和Atg9A的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控自噬作用。
[Abstract]:Tiny RNA (microRNA, miRNA) is a highly conserved noncoding single strand small molecule RNA, which is negatively regulated by multiple complementary mRNAs target genes mRNA at transcriptional or post transcriptional level. In recent years, studies have shown that miRNA is closely related to the pathophysiological processes such as development, aging, immunity and tumor. In the study of rat and nematode microRNA chip, we found that miR-34 was up-regulated with aging. In vitro studies also confirmed that miR-34 could accelerate cell senescence through regulating cell cycle. Autophagy is the process of phagocytosis and degradation of cells through lysosomes, and the regulation of autophagy is the key link of aging related genes such as p53 and SIRT1. Studies have shown that miR-34 participates in the signaling pathways of p53 and SIRT1, suggesting that autophagy may be an important mechanism for the involvement of miR-34 in aging regulation. The purpose of this study was to elucidate the exact role of miR-34 in the aging process and the molecular mechanism of autophagy mediated by miR-34 in the regulation of senescence in the process of aging. The full text is divided into three parts:
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1343252