發(fā)布時(shí)間：2017-12-27 20:15

  本文關(guān)鍵詞：NYD-SP5基因在小鼠睪丸中的表達(dá)及NYD-SP5干擾載體的構(gòu)建　出處：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 基因NYD-SP5 RNA干擾 shRNA 質(zhì)粒 小鼠睪丸

【摘要】： 基因NYD-SP5是Lan-Lan Yin等在人睪丸cDNA microarray差異雜交的基礎(chǔ)上,克隆的一個(gè)新的成人睪丸高度表達(dá)的基因。它由3598個(gè)核苷酸組成,包括1027個(gè)氨基酸開(kāi)放閱讀框架。序列分析顯示基因NYD-SP5與小鼠睪丸基因AK019535的核苷酸序列及其編碼蛋白BAB31783的氨基酸序列具有很高的同源性。這表明基因NYD-SP5是一條人-小鼠同源基因。結(jié)構(gòu)域分析推測(cè)NYD-SP5蛋白是一種跨膜蛋白。 本研究用免疫組化和原位雜交方法研究了基因NYD-SP5在小鼠睪丸組織中的表達(dá)及定位;并構(gòu)建基因NYD-SP5具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA(shRNA)表達(dá)質(zhì)粒。為下一步建立基因NYD-SP5的轉(zhuǎn)基因小鼠模型及研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 方法 用原位雜交法研究小鼠睪丸組織中NYD-SP5 mRNA的表達(dá)及定位;用免疫組化法研究小鼠睪丸組織中NYD-SP5蛋白的表達(dá)及定位。構(gòu)建基因NYD-SP5的4個(gè)pGPU6/GFP-shRNA載體。根據(jù)NYD-SP5 mRNA序列,設(shè)計(jì)有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的4條寡核苷酸序列,克隆到空載體pGPU6/GFP中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,提純及鑒定重組質(zhì)粒,同時(shí)設(shè)計(jì)構(gòu)建分別針對(duì)人GAPDH干擾質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,不針對(duì)任何特異基因的質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。 結(jié)果 原位雜交技術(shù)顯示,在小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中實(shí)驗(yàn)組有棕黃色的染色,對(duì)照組未見(jiàn)棕黃色染色,說(shuō)明NYD-SP5 mRNA存在于小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞中。免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞胞質(zhì)及管腔纖毛中,實(shí)驗(yàn)組有棕黃色染色,對(duì)照組未見(jiàn)棕黃色染色,說(shuō)明NYD-SP5蛋白主要存在于小鼠睪丸生精小管上皮的生精細(xì)胞及管腔纖毛中。酶切電泳分析以及插入基因的序列分析證實(shí),我們?cè)O(shè)計(jì)的堿基序列成功插入到了預(yù)計(jì)位點(diǎn)。經(jīng)重組質(zhì)粒篩選,重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定與設(shè)計(jì)的shRNA轉(zhuǎn)錄模板序列相同,均證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 結(jié)論 小鼠睪丸生精細(xì)胞中存在NYD-SP5 mRNA和蛋白表達(dá),提示該基因可能對(duì)精子的發(fā)生發(fā)揮作用。利用RNA干擾技術(shù)路線可成功構(gòu)建靶向NYD-SP5的發(fā)夾結(jié)構(gòu)小干擾RNA表達(dá)載體。本研究為下一步建立基因NYD-SP5的轉(zhuǎn)基因小鼠模型及研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Gene NYD-SP5 is a new highly expressed gene of adult testis, which is based on the differential hybridization between Lan-Lan Yin and human testicular cDNA microarray. It consists of 3598 nucleotides, including 1027 amino acid open reading frames. Sequence analysis showed that gene NYD-SP5 was highly homologous to the nucleotide sequence of mouse testicular gene AK019535 and the amino acid sequence of the encoded protein BAB31783. This suggests that the gene NYD-SP5 is a human - mouse homologous gene. The domain analysis shows that NYD-SP5 protein is a kind of transmembrane protein.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1343037