本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌臨床菌株主要蛋白抗原表達(dá)及其誘導(dǎo)宿主抗體水平差異性的研究　出處：《浙江大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 幽門螺桿菌感染與人慢性胃炎、消化道潰瘍和胃腺癌的發(fā)病密切相關(guān)。一些抗生素可有效殺滅感染的幽門螺桿菌,但存在再次感染和誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等問題。接種疫苗是預(yù)防傳染病最為經(jīng)濟(jì)和有效的方法,但至今尚無幽門螺桿菌疫苗產(chǎn)品。幽門螺桿菌培養(yǎng)條件苛刻、生長緩慢、產(chǎn)量極低,故基因工程疫苗可能是研發(fā)該菌疫苗唯一可行的途徑。目前最為肯定的幽門螺桿菌蛋白抗原是尿素酶B亞單位(UreB)和幽門螺桿菌黏附素(HpaA),其次是空泡毒素(VacA)、細(xì)胞毒性相關(guān)蛋白(CagA)、中性粒細(xì)胞激活蛋白(NapA)、鞭毛蛋白A亞單位(FlaA)和B亞單位(FlaB)等。然而,不同國家和地區(qū)同種細(xì)菌的優(yōu)勢基因型和抗原表型可有較大差別。 本研究中,我們建立了基于幽門螺桿菌重組蛋白抗原rUreB、rHpaA、rVacA、rCagA1、rNapA、rFlaA和rFlaB及其抗體的ELISAs,檢測了分離自胃炎或消化道潰瘍病人胃黏膜145株幽門螺桿菌臨床菌株上述抗原的表達(dá)情況,以及145例病人血清中上述抗原的IgG抗體;另采用PCR檢測了上述幽門螺桿菌臨床菌株中各抗原編碼基因攜帶情況,以期為研制我國幽門螺桿菌基因工程疫苗的抗原選擇提供較為充分的依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)采用了332例胃炎、消化道潰瘍病人胃黏膜活檢標(biāo)本和血清標(biāo)本,以及35例健康體檢兒童的血清標(biāo)本。采用選擇性哥倫比亞血瓊脂為分離培養(yǎng)基,通過革蘭染色鏡檢、尿素酶試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)對分離的幽門螺桿菌進(jìn)行鑒定。用IPTG誘導(dǎo)rUreB、rHpaA、rVacA、rCagA1、rNapA、rFlaA和rFlaB表達(dá),Ni-NTA親和層析柱和Western Bolt分別提純和鑒定目的表達(dá)產(chǎn)物。制備上述7種重組表達(dá)蛋白抗原的兔抗血清,免疫雙擴(kuò)散法檢測其效價(jià)。用7種重組蛋白為包被抗原,濃度均為2μg/每孔,以病人血清為一抗、HRP標(biāo)記羊抗人IgG為二抗,建立檢測血清標(biāo)本中上述抗原IgG抗體的ELISAs。用幽門螺桿菌NCTC11637株及臨床分離菌株、10株大腸桿菌和10株金黃色葡萄球菌(陰性對照)的超聲波破碎物上清為包被抗原,濃度均為5μg蛋白/每孔,上述7種幽門螺桿菌重組蛋白抗原兔抗血清為一抗、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗,建立檢測幽門螺桿菌臨床菌株中上述7種抗原的ELISAs。采用PCR檢測幽門螺桿菌臨床菌株ureB、hpaA、vacA、cagA、napA、flaA和flaB基因,采用瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,332例慢性胃炎或消化性潰瘍病人胃黏膜活檢標(biāo)本中,幽門螺桿菌分離陽性率為43.8%(145/332)。7種重組蛋白抗原表達(dá)量分別約為細(xì)菌總蛋白的15%～56%,提純后經(jīng)SDS-PAGE后均顯示為單一條帶并可與幽門螺桿菌全菌抗體形成陽性雜交結(jié)果。7種重組蛋白抗原兔抗血清的免疫雙擴(kuò)散效價(jià)1:4～1:8。100%(145/145)、86.9%(126/145)、42.8%(62/145)、70.3%(102/145)、89.7%(130/145)、84.8%(123/145)和79.3%(115/145)幽門螺桿菌感染病人血清標(biāo)本中分別為UreB、HpaA、VacA、CagA、NapA、FlaA和FlaB抗體檢測結(jié)果陽性。所有幽門螺桿菌臨床菌株(100%,145/145)均表達(dá)UreB、HpaA、FlaA和FlaB,52.4%(76/145)、91.7%(133/145)和93.1%(135/145)幽門螺桿菌臨床菌株表達(dá)VacA、CagA和NapA。所有幽門螺桿菌臨床菌株(100%,145/145)ureB、hpaA、vacA、flaA和flaB基因PCR結(jié)果陽性,96.6%(140/145)和97.9%(142/145)幽門螺桿菌臨床菌株cagA和napA基因PCR結(jié)果陽性。 結(jié)論:1.幽門螺桿菌臨床菌株7種蛋白抗原基因攜帶率和表達(dá)率有明顯差異,ureB、hpaA、flaA、flaB、cagA和napA基因均顯示為高攜帶和高表達(dá)狀況,vacA基因攜帶率為100%但表達(dá)率僅為52.4%。2.幽門螺桿菌感染的胃炎、消化道潰瘍病人血清中UreB抗體陽性率為100%,與幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因攜帶率和表達(dá)率相符;NapA、HpaA和FlaA抗體陽性率較高(84.8%～89.7%),但低于幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因攜帶率和表達(dá)率;VacA和CagA抗體陽性率較低(42.8%,70.3%),與幽門螺桿菌臨床菌株中編碼基因高攜帶率或高表達(dá)率之間的差距很大。3.綜合上述7種幽門螺桿菌蛋白抗原基因攜帶、表達(dá)及病人血清抗體陽性率檢測結(jié)果,同時(shí)考慮各重組蛋白抗原表達(dá)產(chǎn)量差異,我們認(rèn)為首先是rUreB、其次是rNapA和rHpaA較為適用于幽門螺桿菌基因重組疫苗的候選抗原。
[Abstract]:Helicobacter pylori infection is closely related to chronic gastritis, peptic ulcers and gastric adenocarcinoma. Some antibiotics can effectively kill the infected Helicobacter pylori, but there are some problems such as reinfection and resistance to bacteria. Vaccination is the most economical and effective way to prevent infectious diseases, but there is no Helicobacter pylori vaccine yet. The cultivation conditions of Helicobacter pylori are harsh, slow growth and very low production, so genetic engineering vaccine may be the only feasible way to develop the vaccine. At present most of Helicobacter pylori antigen is certain urease B subunit (UreB) and Helicobacter pylori (HpaA), followed by the vacuolating cytotoxin (VacA), cytotoxic associated protein (CagA) and neutrophil activating protein (NapA), flagellin subunit A (FlaA) and B unit (FlaB). However, the dominant genotypes and antigen phenotypes of the same bacteria in different countries and regions can be significantly different.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392.1

【引證文獻(xiàn)】

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1 國敏;徐帆洪;;幽門螺桿菌疫苗研究進(jìn)展[A];第五次全國免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2011年

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本文編號：1342901