本文關(guān)鍵詞：IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和IL-33對肺部炎癥的增強作用　出處：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 白細(xì)胞介素33(Interleukin 33, IL-33)是近年發(fā)現(xiàn)的IL-1類細(xì)胞因子家族的成員。它的受體是早于它被發(fā)現(xiàn)的孤兒受體ST2。作為細(xì)胞表面受體的ST2主要表達(dá)于Th2輔助性淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等細(xì)胞表面,IL-33具有促進(jìn)Th2細(xì)胞免疫的作用。而在臨床上IL-33和ST2與自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、心血管疾病和神經(jīng)退行性病變等的發(fā)生發(fā)展相關(guān),從而引起人們的關(guān)注。小鼠腹腔注射重組的IL-33分子,動物表現(xiàn)為呼吸道和消化道的炎癥損傷,脾臟腫大。而對于動物體內(nèi)內(nèi)源性的IL-33表達(dá)上升的研究目前未有報道。在分子結(jié)構(gòu)上IL-33分子具有核定位功能域和IL-1類細(xì)胞因子活性功能域。IL-33分子本身缺乏分泌信號,目前對于IL-33細(xì)胞因子的分泌釋放和它作為活性細(xì)胞因子的分泌形式等都存在著爭議。 為了研究IL-33在小鼠體內(nèi)的內(nèi)源性表達(dá)及其對動物的影響,我們首先從新生小鼠的組織中克隆了小鼠的IL-33基因,并將該基因構(gòu)建到以CMV為啟動子的真核表達(dá)載體pCDNA3.1上,通過顯微注射的方式建立了CMV-mIL-33的轉(zhuǎn)基因小鼠。通過免疫印跡分析檢測到在轉(zhuǎn)基因小鼠的肺臟、心臟、腎臟和胰腺組織中IL-33表達(dá)提高。高表達(dá)的IL-33分子在肺臟組織以18 kDa的形式分泌到呼吸道。通過雙向電泳分析18 kDa分子的等電點性質(zhì),發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的18 kDa的IL-33分子更接近于小鼠IL-33分子中有功能活性的109-266 aa肽段的肽段等電點性質(zhì)。 mIL-33轉(zhuǎn)基因?qū)π∈蟮某錾�、性別比率、體重等并沒有產(chǎn)生影響。大體解剖和組織學(xué)分析沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物的腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸等受到影響。病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的肺臟出現(xiàn)炎癥性反應(yīng)：在支氣管和小血管周圍出現(xiàn)了包括嗜酸性粒細(xì)胞在內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤；在轉(zhuǎn)基因小鼠的呼吸道出現(xiàn)了杯狀細(xì)胞的高反應(yīng)性和粘液性物質(zhì)的聚集；對肺組織灌洗液的分析發(fā)現(xiàn)灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等各類炎性細(xì)胞數(shù)目增加,炎性細(xì)胞因子IL-5、IL-8、IL-13的水平提高,IgE水平提高,同時炎癥抑制性細(xì)胞因子IL-10和可溶性ST2的水平也提高。這些結(jié)果表明IL-33在肺臟組織的過表達(dá)誘發(fā)了小鼠自發(fā)的肺部炎癥反應(yīng)。我們通過轉(zhuǎn)基因的方式研究分析了內(nèi)源性高表達(dá)IL-33,發(fā)現(xiàn)了IL-33在體內(nèi)確實存在剪切,而且剪切出的分子的性質(zhì)更接近活性序列的性質(zhì)。內(nèi)源性轉(zhuǎn)基因的IL-33在肺臟組織得以高表達(dá),促發(fā)了肺部的炎癥反應(yīng),印證了IL-33是一種促炎癥因子。 物種的進(jìn)化是長期自然選擇的結(jié)果,在進(jìn)化過程中物種的遺傳物質(zhì)相應(yīng)也會發(fā)生改變。在本質(zhì)上物種的進(jìn)化是遺傳物質(zhì)——基因組的進(jìn)化,在基因水平包括基因的融合、倒位、易位,基因的丟失和新基因的出現(xiàn)。人類作為靈長類動物他們在1.2億年前和嚙齒類動物具有共同的祖先。但是長期的進(jìn)化使得他們的基因組發(fā)生了變化。根據(jù)目前對部分靈長類和嚙齒類動物基因組測序的結(jié)果,在基因水平每類基因組中大約有1%的基因在另外一類動物的基因組中是找不到的。這樣一類基因被稱為種屬特異基因。 我們通過比較靈長類和嚙齒類動物的基因組找到這樣一些種屬特異基因。XAGE-3是靈長類種屬特異的一個基因。在本論文工作中,我們首先在生物信息學(xué)的水平驗證類人類XAGE-3基因在靈長類動物相對嚙齒類動物的種屬特異性。隨后從人類胎盤組織中克隆了該基因。將該基因插入真核表達(dá)載體pCDNA3.1構(gòu)建了以CMV為啟動子的表達(dá)載體。通過顯微注射的方法得到了XAGE-3的轉(zhuǎn)基因小鼠。分析了轉(zhuǎn)基因小鼠部分組織的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中該基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)該基因在轉(zhuǎn)基因小鼠的小腸、胸腺和睪丸組織有較高表達(dá),利用Brdu標(biāo)記3周齡的雄性轉(zhuǎn)基因小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)XAGE-3轉(zhuǎn)基因小鼠有更多的發(fā)育晚期的精母細(xì)胞被標(biāo)記,人XAGE-3轉(zhuǎn)基因影響到了小鼠生精細(xì)胞的發(fā)育。 MAN2C1是一種α-甘露糖苷酶,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的糖基化。既往的研究表明MAN2C1和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本論文的部分工作研究了hMAN2C1轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟和脾臟組織的α-甘露糖苷酶活性,制備了兔抗人MAN2C1的多克隆抗體并以之分析了所轉(zhuǎn)MAN2C1基因在兩個轉(zhuǎn)基因品系中表達(dá)。以此轉(zhuǎn)基因動物驗證了MAN2C1基因?qū)τ谝浦材[瘤的生長和遷移的影響。為了進(jìn)一步研究MAN2C1的功能,我們制備了MAN2C1基因表達(dá)抑制的基因沉默小鼠。在轉(zhuǎn)錄水平MAN2C1基因表達(dá)被抑制,但組織酶活分析卻沒有發(fā)生明顯改變。
[Abstract]:Interleukin 33 (Interleukin 33, IL-33) is a member of the IL-1 cell factor family found in recent years. Its receptor is earlier than the orphan receptor ST2 that it has been found. ST2, as a cell surface receptor, is mainly expressed in the surface of Th2 assisted lymphocyte and mast cell, and IL-33 has the role of promoting Th2 cell immunity. In clinic, IL-33 and ST2 are associated with the development of autoimmune diseases, allergic diseases, cardiovascular diseases and neurodegenerative diseases. The mice were intraperitoneally injected with recombinant IL-33 molecules, and the animals showed inflammation of the respiratory and digestive tract, and the spleen was swollen. However, there is no report on the increase of endogenous IL-33 expression in animals. On the molecular structure, IL-33 molecules have nuclear location functional domains and IL-1 cell factor active functional domains. The IL-33 molecule itself lacks the secretory signal, and the secretory release of IL-33 cytokine and its secretory form as active cytokine are disputed.
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392;R-332

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本文編號：1342860