本文關(guān)鍵詞：肺、體血管平滑肌細(xì)胞線粒體的異質(zhì)性　出處：《華中科技大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:對(duì)比提取肺動(dòng)脈、股動(dòng)脈、股靜脈平滑肌細(xì)胞(PASMC、FASMC、FVSMC)線粒體方法的成功率差異。 方法:斷頸法處死150g左右的SD雄性大鼠,分離肺動(dòng)脈、股動(dòng)脈、股靜脈血管放置于冰浴的D-Hank’s液中,在顯微鏡下去除血管外膜內(nèi)膜,獲得平滑肌層。平滑肌層放入緩沖液中勻漿,勻漿后加入蛋白酶抑制劑cocktail。勻漿液放入EP管,4℃600g離心5min,取上清置于另一EP管內(nèi),4℃5000g離心10min,所獲沉淀即為線粒體。方法改動(dòng):梯度離心時(shí)兩次離心力改為1000g,10min/10000g,15min;600g,5min/7000g,10min兩種搭配。 結(jié)果:在三種離心速度搭配的改動(dòng)中,線粒體提取成功率有顯著提高。離心力搭配為600g,5min/5000g,10min時(shí),成功率為47.4%;離心力搭配為1000g,10min/10000g,15min時(shí),成功率為50%;離心力搭配為600g,5min/7000g,10min時(shí),成功率為89.8%。 結(jié)論:當(dāng)離心力搭配為600g,5min/7000g,10min時(shí),提取線粒體的成功率最高。 目的:1.提取線粒體后對(duì)比PASMC、FASMC、FVSMC中線粒體數(shù)量的差異。2.用ELISA測(cè)定檸檬酸合成酶(CS)含量間接反應(yīng)線粒體含量。3.通過對(duì)比三種平滑肌細(xì)胞中線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性差異,間接反映三種平滑肌細(xì)胞中線粒體活 性的差異。方法:1.線粒體的提取:斷頸法處死150g的SD雄鼠,取出肺動(dòng)脈、股動(dòng)脈、股靜脈,放置于冰浴的D-Hank’s液中,在顯微鏡下去除血管外膜、內(nèi)膜,獲得平滑肌層。平滑肌層放入緩沖液中勻漿,勻漿后加入蛋白酶抑制劑,之后勻漿液放入EP管4℃600g離心5min,取出上清液放入新的EP管,4℃7000g離心10min,所獲沉淀即為平滑肌層線粒體。2.線粒體計(jì)數(shù):線粒體重懸于100μL配好的Mito-track-green染料中,放置在37℃孵育30min,染色結(jié)束后,4℃7000g離心10min,棄去上清,沉淀重懸于勻漿緩沖液,震蕩混勻后4℃7000g離心15min,即獲得被Mito-track-green著染的純化線粒體。取獲得的已染色的線粒體懸液10μL加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板,在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)數(shù)熒光亮點(diǎn),之后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得出線粒體懸液濃度。3.蛋白濃度測(cè)定:取第一次離心后所得的上清液40μL測(cè)定蛋白含量。線粒體數(shù)/蛋白質(zhì)量=單位質(zhì)量蛋白所含的線粒體數(shù)。4.檸檬酸合成酶含量的測(cè)定:取1步驟中第一次離心后的上清1mL,分為五份,-20℃保存,按ELISA試劑盒說明書測(cè)檸檬酸合成酶含量。5.琥珀酸脫氫酶活性測(cè)定:將提取的線粒體重懸于100μL組織裂解液,4℃冰浴中裂解1小時(shí),之后4℃120000r/min離心5min。取40μL上清液測(cè)蛋白濃度,50μL上清液測(cè)SDH活性。活性測(cè)定方法按照試劑盒說明書操作。 結(jié)果:1.線粒體計(jì)數(shù)結(jié)果:PASMC中線粒體數(shù)為2×106個(gè)/mg pro(n=5),FASMC中線粒體數(shù)為3.5×106個(gè)/mg pro(n=5),FVSMC中線粒體數(shù)為5.6×106個(gè)/mg pro(n=5);三種血管平滑肌細(xì)胞線粒體數(shù)量存在顯著性差異(p0.05)。 2.檸檬酸合成酶含量測(cè)定結(jié)果:(1)PASMC中CS含量為4.43ng/mg pro、FASMC中CS含量為8.46ng/mg pro,FVSMC中CS含量為7.23ng/mg pro。PASMC與FASMC兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3,p0.05);(2)PASMC中單個(gè)線粒體CS含量為1.99×10-3pg、FASMC中單個(gè)線粒體CS含量為1.27×10-3pg、FVSMC中單個(gè)線粒體CS含量為2.40×10-3pg,FASMC與FVSMC兩者間有差異(n=3,p0.05)。 3.琥珀酸脫氫酶活性檢測(cè)結(jié)果:FASMC與FVSMC中SDH活性比PASMC中SDH活性高,FASMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的210.36%(n=6,p0.05);FVSMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的243.45%(n=9,p0.05)。 結(jié)論:1.股靜脈血管平滑肌中線粒體數(shù)量最多,股動(dòng)脈其次,肺動(dòng)脈最少。2. PASMC中CS含量最低,FASMC中CS含量最高;就單個(gè)線粒體而言,FVSMC中CS含量最低,FASMC中CS含量最高。3. FASMC和FVSMC中SDH活性均比PASMC中的SDH活性高,FVSMC中SDH活性最高。
[Abstract]:Objective: To compare the differences in the success rate of mitochondrial methods for extracting pulmonary, femoral and venous smooth muscle cells (PASMC, FASMC, FVSMC).
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉曉華,錢令嘉;線粒體蛋白質(zhì)組研究的進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2003年03期

2 王靜波,胡長(zhǎng)龍,徐宏發(fā);線粒體DNA(mtDNA)多態(tài)性在動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)中的應(yīng)用[J];生物多樣性;2001年02期

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本文編號(hào)：1342512