本文關(guān)鍵詞：高糖對(duì)MAPC細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制的研究　出處：《中南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一章高糖通過(guò)ERK1/2細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)抑制STAT3表達(dá)對(duì)大鼠骨髓來(lái)源MAPC細(xì)胞TGF-β1及VEGF表達(dá)調(diào)控 目的通過(guò)檢測(cè)高糖對(duì)骨髓來(lái)源MAPC細(xì)胞TGF-β1和VEGF表達(dá)水平的影響,探討高糖干預(yù)MAPC細(xì)胞TGF-β1和VEGF表達(dá)的機(jī)制。 方法從鼠骨髓來(lái)源的細(xì)胞中分離、純化得到MAPC細(xì)胞。MAPC細(xì)胞依照一定的種植密度孵育在普通細(xì)胞培養(yǎng)基(含有5.5mM葡萄糖)和高糖培養(yǎng)基中(含有25.5mM葡萄糖)中,最長(zhǎng)孵育時(shí)間14天。MAPC細(xì)胞孵育在含有左旋葡萄糖(20mM左旋葡萄糖+5.5mM葡萄糖)的高滲培養(yǎng)基中,作為高滲對(duì)照,以排除高滲透壓對(duì)細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)中利用Q-RT-PCR.ELISA以及免疫熒光顯微成像分析在不同的時(shí)間點(diǎn)和條件培基中MAPC細(xì)胞TGF-β1mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。同時(shí),利用Q-RT-PCR分析VEGF表達(dá)水平。通過(guò)Western blot分析高糖及普通培養(yǎng)條件下MAPC細(xì)胞ERK1/2以及STAT3激活表達(dá)水平的差異。通過(guò)共聚焦顯微鏡了解不同培養(yǎng)條件下,STAT3亥轉(zhuǎn)移的能力。 結(jié)果在普通低糖培養(yǎng)基中孵育的MAPC細(xì)胞,處TGF-β1和VEGF的表達(dá)均能檢測(cè)到。在高糖培集中孵育36h后TGF-β1mRNA表達(dá)明顯升高,為對(duì)照組的20-fold,同時(shí)其蛋白表達(dá)水平也是對(duì)照組的5倍多。而與此相反,VEGF表達(dá)水平,不論是mRNA表達(dá)還是蛋白質(zhì)表達(dá)均在高糖刺激下明顯下調(diào)。在高糖培基中孵育的MAPC細(xì)胞,其ERK1/2磷酸化水平明顯上調(diào),與此同時(shí),STAT3在Tyr705殘基而不是Ser727殘基,磷酸化水平明顯上調(diào)。通過(guò)ERK1/2上游MEK特效抑制劑PD98059以及U0126的抑制作用,ERK1/2磷酸化水平受到顯著抑制,同時(shí)TGF-β1表達(dá)水平也受到抑制,而磷酸化STAT(Tyr705)水平得到恢復(fù),VEGF表達(dá)也得到恢復(fù)而升高。利用AG490特效性阻斷JAK2達(dá)到特效阻斷磷酸化STAT3(Tyr705)的目的,VEGF表達(dá)下調(diào),而TGF-β1表達(dá)上調(diào),MAPC細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有受到影響。以此說(shuō)明STAT3在調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵作用。 結(jié)論高糖可以通過(guò)ERK1/2信號(hào)途徑調(diào)抑制STAT(Tyr705)磷酸化水平,從而上調(diào)MAPC細(xì)胞TGF-β1表達(dá),抑制VEGF表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明,對(duì)ERK1/2與STAT3信號(hào)通路的調(diào)控是維系MAPC細(xì)胞TGF-β1和VEGF表達(dá)平衡的關(guān)鍵。 目的研究高糖對(duì)骨髓來(lái)源MAPC細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的影響,及其可能的機(jī)制。 方法分離純化鼠骨髓細(xì)胞來(lái)源的MAPC細(xì)胞。該細(xì)胞孵育在普通培養(yǎng)基(含有5.5mM葡萄糖)以及高糖培養(yǎng)基(25.5mM葡萄糖)中,最長(zhǎng)孵育14天。孵育在左旋葡萄糖培基中(20mM左旋葡萄糖+5.5mM葡萄糖)的MAPC細(xì)胞作為高滲透壓培養(yǎng)的對(duì)照組,用于排除高滲對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干預(yù)。通過(guò)FACS(流式細(xì)胞儀)檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下MAPC細(xì)胞的周期變化。Western blot和免疫熒光被用于分析P21Waf1/Cip1和P27Kip1的表達(dá)水平。Smad磷酸化水平通過(guò)Western blot分析。應(yīng)用ELISA和Q-RT-PCR反映TGF-β1在MAPC細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果FACS結(jié)果顯示,MAPC細(xì)胞的G1期延長(zhǎng),而S期縮短,G2期沒(méi)有顯著改變。Western blot以及免疫熒光顯微成像結(jié)果都表明,細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P2l Waf1/Cip1的表達(dá)水平在高糖刺激下升高,而P27Kip1的表達(dá)水平卻沒(méi)有改變。ELISA結(jié)果顯示TGF-β1表達(dá)升高,利用TGF-β1抗體可以有效阻斷TGF-β1表達(dá)。高糖在促進(jìn)TGF-β1表達(dá)的同時(shí),TGF-β2型受體的表達(dá)也隨之增加。但TGF-β2型受體的表達(dá)會(huì)隨時(shí)間而達(dá)到飽和。利用Western blot分析Smad2/3激活水平以及磷酸化CDK2表達(dá)水平。當(dāng)TGF-β1抗體中和了TGF-β1,以及PD98059抑制了ERK1/2的磷酸化時(shí),高糖介導(dǎo)的P21Waf1/Cip1表達(dá)增加,CDK2激活水平的提高,以及最終的MAPC細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的阻滯,都將受到阻止而向相反的趨勢(shì)發(fā)展。與此同時(shí),ERK1/2磷酸化水平的變化可以發(fā)揮調(diào)控Smad信號(hào)途徑的作用。 結(jié)論高糖可以在G1/S期阻斷早期分化階段MAPC細(xì)胞的周期轉(zhuǎn)換,其機(jī)制是通過(guò)TGF-β1介導(dǎo)ERK1/2言號(hào)激活,從而調(diào)控Smad和非Smad信號(hào)途徑影響細(xì)胞周期調(diào)控抑制蛋白P21Waf1/Cip1的表達(dá)水平 目的探討糖對(duì)鼠骨髓來(lái)源MAPC細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞或是平滑肌細(xì)胞分化趨勢(shì)的影響 方法復(fù)蘇凍存的MAPC細(xì)胞,作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源。將MAPC細(xì)胞孵育在不同的條件培養(yǎng)基中：普通低糖培養(yǎng)基含有5.5mM葡萄糖；高糖培養(yǎng)基含有25.5mM葡萄糖；高滲培養(yǎng)基含有20mM左旋葡萄糖和5.5mM葡萄糖。MAPC細(xì)胞孵育在以上條件培養(yǎng)基中最多達(dá)14天。利用Q-RT-PCR分析特異性內(nèi)皮標(biāo)記物vWF、CD31以及Flkl的表達(dá)水平,同時(shí)也分析平滑肌標(biāo)記物α-SMA和SM22-αmRNA水平。Western blot被用于分析以上三種內(nèi)皮標(biāo)記物以及平滑肌標(biāo)記物的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果在高糖的刺激下,Q-RT-PCR分析結(jié)果顯示,vWF, CD31以及Flkl三種內(nèi)皮特異性標(biāo)記物mRNA表達(dá)水平降低。與此相反,通過(guò)TGF-β1抗體預(yù)處理MAPC細(xì)胞,阻斷其分泌后,vWF、CD31和Flk1mRNA農(nóng)達(dá)水平明顯上調(diào),與蛋純高糖刺激存在明顯差異。同時(shí)VVestern blot分析顯示,高糖可以使以上三種內(nèi)皮標(biāo)記物表達(dá)高峰值延遲。在高糖條件下,α-SMA和SM22-α作為特異性平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物,其表達(dá)趨勢(shì)與內(nèi)皮特意性標(biāo)記明顯不同。α-SMA和SM22-α mRNA表達(dá)受到高糖刺激而升高；因高糖刺激而分泌增加的TGF-β1被TGF-β1抗體中和后,其表達(dá)水平受到顯著抑制。 結(jié)論高糖可以提升平滑肌標(biāo)記物表達(dá)水平,同時(shí)抑制內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平。以上現(xiàn)象表明,高糖參與MAPC細(xì)胞分化趨勢(shì)的調(diào)控,誘導(dǎo)MAPC細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞方向分化,提示高糖可以干擾新生血管形成過(guò)程。
[Abstract]:In Chapter 1, high glucose mediated inhibition of STAT3 expression through ERK1/2 cell signaling pathway to regulate the expression of TGF- beta 1 and VEGF in rat bone marrow derived MAPC cells
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 唐力軍,高毅,張志,李浩,單毓強(qiáng);肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子聯(lián)合成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4誘導(dǎo)人骨髓來(lái)源的多能成體祖細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化[J];中華肝臟病雜志;2005年09期

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本文編號(hào)：1341530