發(fā)布時間：2017-12-27 11:10

  本文關(guān)鍵詞：柯薩奇病毒B3 VP1蛋白的原核表達及免疫效果觀察　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 柯薩奇病毒B組3型(CVB3) VP1基因 原核表達質(zhì)粒 亞單位疫苗 小鼠

【摘要】： 目的:柯薩奇病毒的B組(CVB)是人類病毒性心肌炎的主要病原體,以CVB3最為重要,迄今尚無有效的防治手段。VP1是CVB3的主要衣殼蛋白,含有多個T、B細(xì)胞表位,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明,編碼VP1的DNA疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并對感染小鼠具有一定的保護能力,但不能有效阻止致死量病毒感染。推測與DNA疫苗在體內(nèi)進入細(xì)胞的量較少,目的基因表達水平較低有關(guān)。研究表明,蛋白質(zhì)有很強的免疫原性,免疫動物可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價的抗體。據(jù)此,許多人又重新嘗試用蛋白質(zhì)做為疫苗以提高免疫效果。此種疫苗是提取病原體中具有免疫保護作用的蛋白,或利用DNA重組技術(shù)使重組體表達這類蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗,稱為亞單位疫苗。亞單位疫苗不含有感染性組分,無須滅活,也無致病性。自l981年成功地將口蹄疫病毒的VP3基因克隆到大腸埃希氏菌內(nèi)并制成用于牛和豬的疫苗之后,迄今已研制出包括乙型肝炎疫苗在內(nèi)的許多亞單位疫苗用于傳染病的預(yù)防。但也有研究表明,某些病原體亞單位疫苗的免疫原性低,不能達到滿意的免疫保護作用。近年有研究顯示,采用prime-boost方法將亞單位疫苗與DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高疫苗的免疫效果。本研究用原核表達系統(tǒng)中表達CVB3 VP1蛋白,單獨或采用prime-boost方法與CVB3 VP1 DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用免疫小鼠,觀察免疫效果。 方法: 1利用我室前期構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pcDNA3/VP1為模板,用VP1基因的特異性引物進行PCR擴增,將擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌,提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序篩選重組子。2經(jīng)酶切鑒定和測序確認(rèn)后,取雙酶切的VP1片段和經(jīng)過同樣兩種酶酶切的原核表達載體pET-his連接,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1。3將原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1轉(zhuǎn)入表達宿主菌BL21(DE3)pLysS,誘導(dǎo)表達攜帶有6×HIS標(biāo)簽的VP1蛋白,分別利用HIS單抗和CVB3多抗經(jīng)Western-blot鑒定無誤后對目的蛋白進行初步優(yōu)化表達。將大量誘導(dǎo)表達后的菌體在冰浴中超聲破碎,分離上清和包涵體沉淀,對該蛋白的水溶性進行分析。將包涵體溶液進行SDS-PAGE,切下目的條帶,透析袋中透析。定量所得純化后的蛋白。4用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌中大量提取質(zhì)粒pcDNA3/VP1,用聚乙二醇沉淀法進行純化。5動物實驗:將6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為5組,分別為PBS對照組、pcDNA3/VP1質(zhì)粒組、VP1蛋白組、pcDNA3/VP1質(zhì)粒初免—VP1蛋白加強組(以下簡稱質(zhì)粒蛋白組)和VP1蛋白初免—pcDNA3/VP1質(zhì)粒加強組(以下簡稱蛋白質(zhì)粒組),每組18只;純化后的質(zhì)粒用PBS稀釋后,股四頭肌注射免疫小鼠,純化后的蛋白以PBS稀釋后,腹腔注射免疫小鼠,初次免疫用完全弗氏佐劑,加強免疫用不完全弗氏佐劑。每次每只接種100μg;每3周免疫1次,共免疫3次;每次免疫后第14天,內(nèi)眥靜脈取血,分離血清,用微量中和試驗(固定病毒-稀釋血清法)檢測血清中CVB3特異性中和抗體的水平;第3次免疫后3周,每組3只小鼠取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液,采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)法進行特異性淋巴細(xì)胞增殖活性和特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)殺傷活性的檢測;另每組12只小鼠用致死量的CVB3(4LD50)進行腹腔注射,觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后第21天;每組剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻擊,注射病毒后第7天處死,用于血中病毒滴度的測定。 結(jié)果: 1用PCR從質(zhì)粒中擴增出VP1基因片段,DNA測序證實此基因片段與報道的基因序列一致。2成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1,雙酶切結(jié)果證實插入和連接均正確。3在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中成功表達了CVB3 VP1蛋白,表達蛋白主要以包涵體形式存在。Western-blot證實表達的蛋白可與HIS單抗和CVB3多抗產(chǎn)生特異性反應(yīng)。4不同免疫次數(shù),各組血清中和抗體的平均效價分別為:PBS對照組未檢測到;pcDNA3/VP1質(zhì)粒組1:5.62,1:15.85,1:23.71;VP1蛋白組1:8.91,1:44.67,1:70.79;質(zhì)粒蛋白組1:5.62,1:15.85,1:33.5;蛋白質(zhì)粒組1:8.91,1:44.67,1:56.23。單因素方差分析表明,三次免疫后,除PBS組外,其余各組中和抗體滴度逐次增加(P0.05);三次免疫后,蛋白組、質(zhì)粒蛋白組和蛋白質(zhì)粒組中和抗體滴度高于pcDNA3/VP1組(P0.05)。5小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖實驗分別以CVB3和刀豆蛋A(concanavalin A, ConA)體外刺激淋巴細(xì)胞,檢測細(xì)胞增殖活性。單因素方差分析表明,以CVB3刺激時,與PBS組和pcDNA3/VP1組相比,蛋白質(zhì)粒組的增殖活性顯著升高(P0.05);以ConA刺激時,蛋白組和蛋白質(zhì)粒組均顯著高于PBS組(P0.05)。6小鼠脾臟特異性CTL殺傷活性經(jīng)單因素方差分析表明,質(zhì)粒蛋白組在所有實驗組中殺傷活性最高,PBS免疫組則最低,但兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)意義。7用4LD50攻擊小鼠,各組21天生存率分別為:蛋白組、質(zhì)粒蛋白組和蛋白質(zhì)粒組生存率達33.33%,而pcDNA3/VP1質(zhì)粒組僅為8.33% , PBS組無存活。經(jīng)χ2檢驗,蛋白組、質(zhì)粒蛋白組和蛋白質(zhì)粒組和對照組比較均差別有統(tǒng)計學(xué)意義。加強組小鼠的生存狀況好于PBS組和pcDNA3/VP1質(zhì)粒組(P0.05)。8與幾個對照組相比,蛋白組、質(zhì)粒蛋白組和蛋白質(zhì)粒組小鼠血中病毒滴度顯著降低(P0.05)。 結(jié)論:1成功構(gòu)建了CVB3VP1基因原核表達質(zhì)粒pET-his/VP1。2成功表達、純化出CVB3 VP1蛋白。3小鼠血清中和抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而提高,三次免疫后,VP1蛋白參與的三種免疫方法誘導(dǎo)的和抗體水平高于DNA疫苗組。4蛋白-質(zhì)粒免疫加強法能夠增強小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性和特異性CTL殺傷水平。5用致死量CVB3攻擊小鼠后,蛋白組、質(zhì)粒蛋白組和蛋白質(zhì)粒組的小鼠生存率和存活時間均有所提高。
[Abstract]:Objective: the B group (CVB) of Coxsackie virus (Coxsackie virus) is the main pathogen of human viral myocarditis, and CVB3 is the most important. So far, there is no effective control method. VP1 is the main capsid protein of CVB3, which contains multiple T and B cell epitopes, which can induce immune response in the body. Studies have shown that the DNA vaccine encoding VP1 can induce humoral and cellular immune responses in mice, and has a certain protective ability to infected mice, but it can not effectively prevent fatal viral infection. It is presumed that the amount of DNA vaccine in the body is less, and the expression level of the target gene is relatively low. Studies have shown that protein has a strong immunogenicity, and immune animals can induce high - efficiency antibodies. On this basis, many people try to use protein as a vaccine to improve the immune effect. The vaccine is an immune protective protein extracted from pathogens, or a recombinant vaccine made of recombinant proteins, peptides or synthetic peptides by DNA recombination technology. It is called subunit vaccine. Subunit vaccines do not contain infectious components, without inactivation or pathogenicity. Since l981 successfully cloned the VP3 gene of foot-and-mouth disease virus into Escherichia coli and made it into the vaccine for Niu Hezhu, so far, many sub unit vaccines including hepatitis B vaccine have been developed for the prevention of infectious diseases. However, some studies have shown that the immunogenicity of some subunit vaccines of some pathogens is low and can not achieve satisfactory immune protection. In recent years, studies have shown that the combination of subunit vaccine and DNA vaccine by using prime-boost method can obviously improve the immune effect of the vaccine. In this study, CVB3 VP1 protein was expressed in prokaryotic expression system, and immunized mice were immunized with CVB3 VP1 DNA vaccine alone or by prime-boost, and the immune effect was observed.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1341454