本文關鍵詞：Kindlin-2與Prdx4之間的相互作用研究

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【摘要】：Kindlin是上世紀50年代新發(fā)現(xiàn)的黏著斑蛋白家族,到目前為止,已確定該家族含有3個成員(Kindlin-1, Kindlin-2, Kindlin-3)。越來越多的證據(jù)表明Kindlins通過整合素在細胞黏附中起到重要作用,已有研究證實它們與皮膚疾病發(fā)生、心血管生成、免疫系統(tǒng)功能、腫瘤的侵襲、腫瘤耐藥等有密切關系,它們作為信號分子參與了細胞黏附、遷移、增殖和分化的調控。 Kindlin家族不僅具有高度的同源性,還具有高度的保守性。Kindlin-2與Kindlin-1蛋白有62%的氨基酸相同,Kindlin-3與Kindlin-1有49%的氨基酸相同,Kindlin-2與Kindlin-3有53%的氨基酸相同。Kindlin含有一個典型的FERM結構域,這種結構多見于細胞骨架蛋白。它由3個亞結構域組成,分別為F1、F2、F3,在核心序列前往往有F0亞結構域。Kindlins中的F3與踝蛋白(talin) FERM中的F3高度相似,同樣含有磷酸酪氨酸結合區(qū)(phosphotyrosine-binding domain, PTB),這種結構域可結合整合素β3亞基胞質尾區(qū)。 Kindlin-2定位于細胞-細胞外基質黏著點,直接與整合素連接激酶(integrin-linked kinase, ILK)和黏附結構蛋白相互作用,并且Kindlin-2或黏附結構蛋白的下調可導致細胞延展受損。Kindlin-1和Kindlin-2都可以通過結合整合素胞質尾段定位于黏著斑。Kindlin-2連接黏附結構蛋白,黏附結構蛋白結合血管擴張激活的磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein, VASP)和細絲蛋白(filamin),成為細胞-基質黏附復合體與肌動蛋白細胞骨架之間的重要連接。Kindlin-2對整合素的激活起著至關重要的作用。Kindlin-2的信號傳導分為兩部分,即信號由內到外傳導和由外到內的傳導過程。盡管多種蛋白質都能與β整合素胞內段相互作用,但在Kindlin的功能得到闡明之前,只有踝蛋白被確切證實能夠觸發(fā)整合素活化。然而事實上,在小鼠基因敲除的研究中,證實了Kindlin才是整合素活化所必需的。 Kindlin-2有可能在癌癥的發(fā)生和進展中也扮演著重要角色。許多研究都表明,Kindlin-2的表達水平改變與某些腫瘤密切相關。我們的前期研究也證實,Kindlin-2的表達水平不但與前列腺癌的惡性程度密切相關,而且調控著前列腺癌細胞對順鉑的敏感性。另外,Kindlin-2在不同肺癌細胞系中表達不同,且其過表達可顯著促進U-1752細胞的遷移。Kindlin家族成員可能通過與整合素的作用來參與腫瘤侵襲和轉移過程的調節(jié),但其機制還遠未闡明。 鑒于Kindlin-2在整合素活化中的關鍵性作用以及與某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展的密切相關性,我們開展了尋找新的Kindlin-2相互作用蛋白的工作。在前期研究中,我們利用特異性抗Kindlin-2抗體對前列腺癌細胞系PC-3細胞裂解物進行pulldown,樣品利用2-D熒光差異蛋白表達分析系統(tǒng)(2-DDIGE)進行分析。2-DDIGE系統(tǒng)是在傳統(tǒng)雙向電泳技術的基礎上,結合了多重熒光分析的方法,在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品,獲得差異點后,我們利用全自動凝膠取點、酶解、點樣工作站對差異點進行處理,隨后用4800型MALDI-TOF/TOF分析儀對差異點進行質譜鑒定。在得出的差異點中,其中一個令人感興趣的蛋白是過氧化物酶蛋白(peroxiredoxin, Prdx)家族的一個成員Prdx4。 過氧化物酶蛋白是一個多功能蛋白家族,它有清除生物體內氧自由基的作用,研究表明長期的體能鍛煉能上調過氧化物酶蛋白的表達,以及結合許多慢性疾病過程中所產(chǎn)生的氧自由基,同樣在免疫應激條件下,過氧化物酶蛋白呈過氧化狀態(tài)以此保護機體免受損傷。過氧化物酶蛋白家族成員分子量大小在20～30kDa范圍內,且廣泛分布在生物體內。在大多數(shù)人類細胞中,它占到可溶性蛋白的0.1-1%,并且是紅細胞胞質的第三大蛋白。過氧化物酶蛋白家族的六個亞型在人體的定位有顯著的區(qū)別,根據(jù)該家族蛋白參與氧化還原反應的半胱氨酸殘基數(shù)目,將其家族分為三類：即典型的2-Cys-Prdx (Prdx1～4),非典型的2-Cys-Prdx (Prdx5),以及1-Cys-Prdx (Prdx6)。 越來越多的證據(jù)提示Prdx的表達水平與腫瘤密切相關,甚至有人提出Prdx可作為腫瘤標志物。例如,Prdx3和Prdx4在前列腺癌中的表達都明顯增加,且Prdx4被提出可作為前列腺癌活檢的生物標志物。另外,在肺癌中也發(fā)現(xiàn)Prdx4的表達上調。細胞過表達Prdx2時對順鉑的耐受性增加,而下調其表達則促進順鉑誘導的細胞死亡。鑒于Prdx4參與氧化應激且與腫瘤之間的密切關系,且我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Kindlin-2也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有高度相關性,因而我們推測Prdx4與Kindlin-2的相互作用可能參與了炎癥導致的腫瘤發(fā)生發(fā)展的調控。 基于以上認識,我們在本課題研究中,開展了以下工作： 第一部分：pmcherry-Nl-Prdx4和pEGFP-C3-Kindlin-2載體的構建及鑒定 將帶有紅色熒光蛋白pmcherry和增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的融合蛋白表達載體中分別引入人Prdx4和Kindlin-2全長序列,完成了融合蛋白表達載體pmcherry-N1-Prdx4和pEGFP-C3-Kindlin-2的構建。融合了EGFP的Kindlin-2和1ncherry的Prdx4在細胞內具有高效的表達能力,且無細胞選擇性。構建完成的pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4載體轉染入宿主細胞后,不但有助于觀察其細胞內定位情況,而且還可用于后續(xù)的功能實驗和實時動態(tài)實驗。 第二部分：Kindlin-2與Prdx4相互作用的驗證 1、外源性免疫共沉淀驗證Kindlin-2與Prdx4相互作用 為了明確Kindlin-2與Prdx4是否有相互作用,我們將HA標記的Prdx4載體與FLAG標記的Kindlin-2載體轉染COS-7細胞后進行免疫共沉淀,并設單轉染組作為對照,結果證實兩者具有相互作用。鑒于Prdx4是一種過氧化物酶,我們想進一步了解氧化應激對兩者的相互作用有何影響,選取90min作為刺激時間。結果發(fā)現(xiàn),細胞在受到H202刺激后,兩者的相互作用較刺激前顯著增加。 2、內源性免疫共沉淀驗證Kindlin-2與Prdx4相互作用 我們首先分別用NaAsO2刺激PC-3細胞0min、5min、15min、30min、45min、60min、90min和120min, Western blot檢測了細胞內Kindlin-2和Prdx4的表達量,結果發(fā)現(xiàn)二者的表達量隨著時間的延長并未發(fā)生變化。接著收取PC-3細胞做內源性的免疫共沉淀實驗,選擇NaAsO2刺激90min組,設不加刺激組和無關抗體組作為對照。結果證實兩者具有相互作用,且細胞在受到NaAsO2刺激后兩者的相互作用較刺激前顯著增加,與外源性免疫共沉淀實驗結果相一致。 第三部分：Kindlin-2和Prdx4在細胞內的共定位 1、外源性Kindlin-2與Prdx4在細胞內的共定位 我們將pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4共轉染PC-3細胞,并檢測到在細胞內皆有表達,然后用共聚焦顯微鏡觀察二者在空間位置上有無共定位現(xiàn)象。同樣選擇NaAsO2刺激90min組,設不加刺激組和共轉EGFP空載體與pmcherry-N1-Prdx4組作為對照。結果提示：pEGFP-C3-Kindlin-2在胞漿與胞核中均有分布,而pmcherry-N1-Prdx4主要分布在胞質,在NaAsO2未刺激組中pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4有少量的共定位,細胞在受到NaAsO2刺激后兩者的共定位較刺激前顯著增加。 2、內源性Kindlin-2與Prdx4在細胞內的共定位 我們進一步在PC-3細胞中做內源性的免疫熒光實驗,分別用紅色熒光和綠色熒光標記Prdx4和Kindlin-2,選擇NaAsO2刺激90min組,設不加刺激組和單轉EGFP空載體組作為對照。結果提示：在未受刺激時,Kindlin-2主要分布在胞漿和胞核中,而Prdx4只分布于胞漿中,Prdx4與Kindlin-2有少量共定位；NaAsO2刺激后兩者共定位顯著增強,與外源性結果相一致。 通過以上研究,我們得出以下幾點結論： 1、完成pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4融合載體的構建及鑒定,并在PC-3細胞內有穩(wěn)定的表達。 2、外源性免疫共沉淀實驗初步證實H202刺激可明顯誘導Kindlin-2與Prdx4的相互作用。 3、內源性免疫共沉淀實驗證實NaAsO2刺激可顯著增強Kindlin-2與Prdx4之間的相互作用。 4、熒光蛋白標記的Kindlin-2與Prdx4在空間位置上具有共定位現(xiàn)象,且在NaAsO2刺激后共定位增強。 5、內源性免疫熒光實驗證實Kindlin-2與Prdx4有共定位現(xiàn)象,且在NaAsO2刺激后共定位增強。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 郜鑫;尚靜;楊敬林;李前;陳田;龐元捷;張文曉;欒先國;朱彤;賈光;;黑碳和臭氧處理的黑碳對小鼠遺傳損傷的比較研究[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2014年03期

2 張琴;黃濤;卓強;鄭人源;;肝纖維化中MAPK信號轉導通路對肝星狀細胞活性的影響[J];成都醫(yī)學院學報;2014年04期

3 丁麗;江濤;;p38 MAPK信號通路與慢性阻塞性肺疾病[J];重慶醫(yī)學;2014年23期

4 王冰;于明;武岳;李川;姚天明;;JNK蛋白在白藜蘆醇抗心肌缺血再灌注損傷中作用[J];創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學;2014年04期

5 Siriwan Tangjitgamol;Jitti Hanprasertpong;Marta Cubelli;Claudio Zamagni;;Neoadjuvant chemotherapy and cytoreductive surgery in epithelial ovarian cancer[J];World Journal of Obstetrics and Gynecology;2013年04期

6 唐錦華;吳江;連繼勤;;ROS介導的JNK信號通路及其對細胞自噬的調節(jié)[J];重慶醫(yī)學;2015年06期

7 鄔善敏;柯文杰;袁方均;張小霞;;DAMPs對人肝癌HepG2細胞增殖能力影響的機制研究[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2013年05期

8 許榮;張潔;李丹;;C反應蛋白在晚期肺癌診療中的評估[J];大家健康(學術版);2013年23期

9 董靜梅;潘紅霞;汪繼兵;;運動誘導中性粒細胞的呼吸爆發(fā)及其氧化應激損傷——運動性疲勞的自由基學說的活性氧產(chǎn)生特點及其途徑之一[J];南京體育學院學報(自然科學版);2013年05期

10 劉頤軒;宋桉;王蕓;段力園;宋光耀;;氧化應激在肥胖及胰島素抵抗中的作用研究進展[J];解放軍醫(yī)藥雜志;2014年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙海霞;Ying Li;Yuzhong Wang;Jing Zhang;Xiaoming Ouyang;Renxiu Peng;Jing Yang;;蜈蚣糖肽抗腫瘤和免疫調節(jié)活性的研究(英文)[A];第十一屆全國博士生學術年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（上冊，，大會報告）[C];2013年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王鑫鑫;SIRT1對胃癌惡性生物學行為的影響及作用機制研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2013年

2 張晨光;HTLV-1病毒Tax蛋白對T淋巴細胞HMGB1基因轉錄調控機制的研究[D];華中科技大學;2013年

3 郭靚;炎性因子OSM誘導乳腺癌惡性演進的分子機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2013年

4 劉欣;CXCR1/CXCR2受體拮抗劑-G31P對前列腺癌的抑制作用及機制研究[D];大連醫(yī)科大學;2012年

5 鄭軍;聚合物化學性質和表面拓撲結構對內皮細胞黏附的影響[D];武漢理工大學;2013年

6 丁松明;腫瘤微環(huán)境不同成分在肝癌侵襲轉移中的作用研究[D];浙江大學;2013年

7 何斐;炎癥信號通路基因多態(tài)性、環(huán)境因素及肺炎衣原體感染與原發(fā)性肺癌易感性及預后研究[D];福建醫(yī)科大學;2013年

8 孔帥;MiR-451作用淋巴細胞遷移抑制因子對大腸癌細胞LoVo的影響[D];華中科技大學;2013年

9 李楠;小鼠巨噬細胞S100A9/NF-κB/SAA3/miR-204環(huán)路在炎癥相關性結腸癌發(fā)展中的作用[D];中南大學;2013年

10 楊建棟;NDRG2在肝損傷修復過程中的表達和功能研究[D];第四軍醫(yī)大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 帥欣艷;中性粒細胞—淋巴細胞比率（NLR）與肺癌患者臨床病理特征關系的研究[D];山東大學;2013年

2 陳紅梅;乳腺癌間質反應的X線表現(xiàn)與其侵襲程度關系的研究[D];鄭州大學;2013年

3 屠燕;IL-17在甲狀腺乳頭狀癌中的表達與臨床意義[D];南京醫(yī)科大學;2013年

4 鄭秀麗;賁門腺上皮不同癌變階段間質成纖維細胞的初步研究[D];河北醫(yī)科大學;2013年

5 范洪君;EphA3在胃癌中的表達及其與胃癌血管生成及預后的相關性研究[D];河北醫(yī)科大學;2013年

6 蔡慧蕓;JNK信號轉導通路在去甲斑蝥素誘導肝癌細胞凋亡中的作用[D];河北醫(yī)科大學;2013年

7 李涵;富勒烯衍生物調控腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞功能的初步研究[D];河北醫(yī)科大學;2013年

8 陳士光;�；撬峒岸蜇惿程箤︽滊遄艟刂乱葝uβ細胞損傷的保護作用[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

9 申平;子宮內膜樣腺癌患者組織與血清中YKL-40蛋白的表達[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

10 劉麗;卵巢癌不同淋巴結轉移潛能細胞分泌蛋白差異分析及淋巴管微環(huán)境誘導其上皮間質轉化的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

本文編號：1278503