本文關(guān)鍵詞：MBP原核表達(dá)及其對樹突狀細(xì)胞表型和功能成熟的影響

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【摘要】：背景和目的 麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein, MBP)是近年發(fā)現(xiàn)的免疫佐劑,它可提高重組亞單位疫苗的免疫原性。研究發(fā)現(xiàn),MBP具有廣泛的免疫活性,可激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞；也可通過TLR4活化DC,產(chǎn)生前炎癥因子參與免疫。由此提示MBP可作為免疫增強(qiáng)劑,單獨(dú)作用時也可提高機(jī)體免疫應(yīng)答。 DC是功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC),是唯一能直接激活初始T細(xì)胞的專職性APC,在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮著重要的作用。DC的發(fā)育分為成熟與未成熟階段,兩者具有不同的生物學(xué)特征和細(xì)胞表型。非成熟DC低表達(dá)MHC分子和CD40、CD54、CD80、CD86等共刺激分子和粘附分子；成熟的DC高表達(dá)CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40等共刺激分子,和細(xì)胞間粘附分子ICAM-1(CD54)等。 迄今,有關(guān)MBP的研究,主要集中在研究MBP融合重組蛋白的活性。然而關(guān)于MBP直接作用于免疫系統(tǒng),并提高疫苗免疫應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制還不清楚。所以,本課題通過構(gòu)建MBP原核表達(dá)載體,表達(dá)并分離純化MBP,在此基礎(chǔ)上,研究MBP對DC分化和功能成熟的影響。旨在為闡明MBP作為新型免疫增強(qiáng)劑的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗依據(jù),為疫苗佐劑的研究提供新的線索。 方法 1.構(gòu)建MBP原核表達(dá)系統(tǒng)：以大腸桿菌K12DNA為模板,PCR擴(kuò)增malE基因并構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng)。采用SDS-PAGE檢測目的蛋白MBP表達(dá)情況,Amylose Resin柱提純MBP. Western Blot鑒定MBP的免疫反應(yīng)性。 2.DC2.4細(xì)胞系的培養(yǎng)：DC2.4培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含300mg/L谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)。 3.實(shí)驗分組：實(shí)驗分為3組,1)空白對照組；2)1μg/ml MBP組；3)5μg/ml MBP組。收集DC2.4細(xì)胞,各組分別用以下方式處理：1)空白對照組,即DC2.4組；2)DC2.4+1μg/ml MBP;3)DC2.4+5μg/ml MBP.然后將24孔板放入37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)10h。收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清,分別用于DC表型和細(xì)胞因子濃度檢測。實(shí)驗重復(fù)3次。 4.DC2.4表型變化的檢測：流式細(xì)胞術(shù)分析DC表面分子CD40、CD54、CD80、 CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ表達(dá)。 5.細(xì)胞因子檢測：ELISA檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12及IL-23的濃度。 結(jié)果 1.所克隆的malE基因DNA序列與文獻(xiàn)報道完全相同。所構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)能成功表達(dá)MBP蛋白。Western Blot鑒定后確為MBP蛋白。 2.MBP可刺激DCs表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ分子表達(dá),MHC-Ⅱ分子的表達(dá)略有下降。 未處理組DC2.4表面CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的相對平均熒光強(qiáng)度(ΔMFI)分別為23.45±1.68、335.15±6.55、3.54±0.36、60.75±4.18、250.15±5.43和64.35±6.02；DC2.4與1MBP共培養(yǎng)之后,ΔMFI分別為35.65±1.30、412.15±10.27、5.45±0.20、145.15±6.55、343.15±13.21和43.05±4.15；DC2.4與5μg/mL MBP共培養(yǎng)之后,ΔMFI分別為31.45±1.95、410.15±4.52、5.51±0.20、150.15±7.01、391.15±6.66和25.05±4.42。與未處理組相比,MBP處理組DC2.4表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86和MHC-1分子表達(dá)增加,MHC Ⅱ分子的表達(dá)下降。 3.MBP增強(qiáng)DCs分泌IL-23,但對IL-1β、IL-6和IL-12的表達(dá)無顯著影響。 未處理組DC2.4培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-1βIL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):1025.50±35.36、311.9±27.02、18.4±1.15和2.3±2.08；1μg/mL MBP處理后,培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):937.00±53.03、332.8±1.09、16.5±0.86和26.4±2.08；5μg/mL MBP處理后,培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):945.50±21.21、311.13±21.58、16.5±2.29和26.44±2.12,而數(shù)據(jù)表明：與未處理組DC2.4相比,MBP處理組DC2.4分泌IL-23增加, IL-1β、IL-6、IL-12無顯著變化。 結(jié)論 MBP可能可促進(jìn)DC對內(nèi)源性抗原的提呈,抑制DC對外源性抗原的提呈；促進(jìn)DCs分泌細(xì)胞因子IL-23,可能促進(jìn)Th17亞群的分化、擴(kuò)增和存活。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 趙小霞;馬吉春;方芳;周靜;宋獻(xiàn)美;柳忠輝;臺桂香;;大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)誘導(dǎo)小鼠Th1細(xì)胞的活化作用[J];中國免疫學(xué)雜志;2009年06期

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本文編號：1267504