本文關鍵詞：MBP原核表達及其對樹突狀細胞表型和功能成熟的影響

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【摘要】：背景和目的 麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein, MBP)是近年發(fā)現(xiàn)的免疫佐劑,它可提高重組亞單位疫苗的免疫原性。研究發(fā)現(xiàn),MBP具有廣泛的免疫活性,可激活NK細胞、巨噬細胞和Th1細胞；也可通過TLR4活化DC,產(chǎn)生前炎癥因子參與免疫。由此提示MBP可作為免疫增強劑,單獨作用時也可提高機體免疫應答。 DC是功能最強的專職性抗原提呈細胞(antigen-presenting cell, APC),是唯一能直接激活初始T細胞的專職性APC,在固有免疫和適應性免疫中均發(fā)揮著重要的作用。DC的發(fā)育分為成熟與未成熟階段,兩者具有不同的生物學特征和細胞表型。非成熟DC低表達MHC分子和CD40、CD54、CD80、CD86等共刺激分子和粘附分子；成熟的DC高表達CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40等共刺激分子,和細胞間粘附分子ICAM-1(CD54)等。 迄今,有關MBP的研究,主要集中在研究MBP融合重組蛋白的活性。然而關于MBP直接作用于免疫系統(tǒng),并提高疫苗免疫應答反應的機制還不清楚。所以,本課題通過構建MBP原核表達載體,表達并分離純化MBP,在此基礎上,研究MBP對DC分化和功能成熟的影響。旨在為闡明MBP作為新型免疫增強劑的分子機制提供新的實驗依據(jù),為疫苗佐劑的研究提供新的線索。 方法 1.構建MBP原核表達系統(tǒng)：以大腸桿菌K12DNA為模板,PCR擴增malE基因并構建其原核表達系統(tǒng)。采用SDS-PAGE檢測目的蛋白MBP表達情況,Amylose Resin柱提純MBP. Western Blot鑒定MBP的免疫反應性。 2.DC2.4細胞系的培養(yǎng)：DC2.4培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含300mg/L谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)。 3.實驗分組：實驗分為3組,1)空白對照組；2)1μg/ml MBP組；3)5μg/ml MBP組。收集DC2.4細胞,各組分別用以下方式處理：1)空白對照組,即DC2.4組；2)DC2.4+1μg/ml MBP;3)DC2.4+5μg/ml MBP.然后將24孔板放入37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)10h。收集細胞和培養(yǎng)上清,分別用于DC表型和細胞因子濃度檢測。實驗重復3次。 4.DC2.4表型變化的檢測：流式細胞術分析DC表面分子CD40、CD54、CD80、 CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ表達。 5.細胞因子檢測：ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12及IL-23的濃度。 結果 1.所克隆的malE基因DNA序列與文獻報道完全相同。所構建的原核表達系統(tǒng)能成功表達MBP蛋白。Western Blot鑒定后確為MBP蛋白。 2.MBP可刺激DCs表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ分子表達,MHC-Ⅱ分子的表達略有下降。 未處理組DC2.4表面CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的相對平均熒光強度(ΔMFI)分別為23.45±1.68、335.15±6.55、3.54±0.36、60.75±4.18、250.15±5.43和64.35±6.02；DC2.4與1MBP共培養(yǎng)之后,ΔMFI分別為35.65±1.30、412.15±10.27、5.45±0.20、145.15±6.55、343.15±13.21和43.05±4.15；DC2.4與5μg/mL MBP共培養(yǎng)之后,ΔMFI分別為31.45±1.95、410.15±4.52、5.51±0.20、150.15±7.01、391.15±6.66和25.05±4.42。與未處理組相比,MBP處理組DC2.4表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86和MHC-1分子表達增加,MHC Ⅱ分子的表達下降。 3.MBP增強DCs分泌IL-23,但對IL-1β、IL-6和IL-12的表達無顯著影響。 未處理組DC2.4培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-1βIL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):1025.50±35.36、311.9±27.02、18.4±1.15和2.3±2.08；1μg/mL MBP處理后,培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):937.00±53.03、332.8±1.09、16.5±0.86和26.4±2.08；5μg/mL MBP處理后,培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量分別為(pg/mL):945.50±21.21、311.13±21.58、16.5±2.29和26.44±2.12,而數(shù)據(jù)表明：與未處理組DC2.4相比,MBP處理組DC2.4分泌IL-23增加, IL-1β、IL-6、IL-12無顯著變化。 結論 MBP可能可促進DC對內源性抗原的提呈,抑制DC對外源性抗原的提呈；促進DCs分泌細胞因子IL-23,可能促進Th17亞群的分化、擴增和存活。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 趙小霞;馬吉春;方芳;周靜;宋獻美;柳忠輝;臺桂香;;大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(MBP)誘導小鼠Th1細胞的活化作用[J];中國免疫學雜志;2009年06期

2 ;Fusion expression of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein in E.coli[J];World Journal of Gastroenterology;2005年03期

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本文編號：1267504