本文關(guān)鍵詞：ANP32A基因敲減對體外多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

  更多相關(guān)文章： ANP32A 心肌細(xì)胞凋亡 多柔比星 bcl-2/bax miR-21

【摘要】：目的： 通過體外實驗觀察敲減ANP32A基因?qū)Χ嗳岜刃钦T導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的機(jī)制。并進(jìn)一步探討ANP32A與miR-21在心肌細(xì)胞中的關(guān)系，為心力衰竭提供新的治療策略。 方法： (1)通過PCR技術(shù)體外合成ANP32A對應(yīng)基因片段，定向克隆至U6-vshRNA-CMV-GFP慢病毒表達(dá)載體，構(gòu)建ANP32A基因敲減慢病毒表達(dá)載體（ANP32A/GV115-RNAi）；用同樣的方法構(gòu)建miR-21基因過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體（rno-miR-21(Ubi)）。 (2)實驗分五組：①control組：即空白對照組，僅SD大鼠乳鼠的原代心肌細(xì)胞；②GFP組：即空載體組，轉(zhuǎn)染NC-GFP-LV至心肌細(xì)胞；③DOX組：心肌細(xì)胞+多柔比星（DOX）；④ANP32A敲減組：轉(zhuǎn)染ANP32A基因敲減慢病毒表達(dá)載體至心肌細(xì)胞；⑤ANP32A敲減+DOX組：轉(zhuǎn)染ANP32A基因敲減慢病毒表達(dá)載體至心肌細(xì)胞后加入多柔比星（DOX）。 (3)培養(yǎng)SD大鼠乳鼠的原代心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞鑒定；通過PCR、westernblot方法檢測ANP32A在心肌細(xì)胞中的表達(dá)；心肌細(xì)胞培養(yǎng)后加入不同濃度的多柔比星（DOX）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞凋亡率，MTT方法檢測細(xì)胞的存活率；轉(zhuǎn)染ANP32A基因敲減慢病毒表達(dá)載體至心肌細(xì)胞后加入DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，通過MTT方法檢測細(xì)胞的存活率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，western blot檢測bcl-2及bax蛋白的表達(dá)；轉(zhuǎn)染miR-21基因過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體至心肌細(xì)胞，檢測ANP32A的表達(dá)差異性。 (4)實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行多組間單因素方差分析或t檢驗，P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： (1) Western blot鑒定及DNA測序表明， ANP32A基因敲減慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功；PCR及DNA測序表明miR-21基因過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。分別轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞72h后，轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到70%以上，， Western blot結(jié)果顯示ANP32A的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-21的mRNA表達(dá)上調(diào)。因此，本實驗選擇轉(zhuǎn)染72h作為進(jìn)一步研究的時間點。 (2) ANP32A在SD大鼠乳鼠的原代心肌細(xì)胞中有表達(dá)。 (3)轉(zhuǎn)染ANP32A基因敲減慢病毒表達(dá)載體后加入DOX干預(yù)（ANP32A敲減+DOX組）與僅加入多柔比星組（DOX組）相比心肌細(xì)胞的凋亡率顯著減少；ANP32A敲減+DOX組與DOX組相比，bcl-2的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)， bax的蛋白明顯下調(diào)；敲減ANP32A基因部分抑制了多柔比星（DOX）所產(chǎn)生的效應(yīng)。 (4)轉(zhuǎn)染miR-21基因過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體后的心肌細(xì)胞中ANP32A的表達(dá)水平明顯低于空白對照組。 結(jié)論： (1) ANP32A在SD大鼠乳鼠的原代心肌細(xì)胞中有表達(dá) (2)敲減ANP32A基因明顯抑制多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡， ANP32A具有促心肌細(xì)胞凋亡的作用。 (3)過表達(dá)miR-21可抑制心肌細(xì)胞中ANP32A的表達(dá)，ANP32A可能為miR-21在心臟上的另一個靶點。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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本文編號：1252418