發(fā)布時(shí)間：2017-11-24 05:19

  本文關(guān)鍵詞：人組織激肽釋放酶試劑盒的研發(fā)

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【摘要】：研究表明激肽,激肽-緩激肽系統(tǒng)在心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、腫瘤等起作用,此外我們的前期研究證實(shí),人激肽釋放酶在血液中的含量與缺血性腦中風(fēng)的相關(guān)性顯示其可以作為腦卒中體外診斷的一項(xiàng)重要參與指標(biāo)。鑒于多項(xiàng)研究及我們前期所作實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們研發(fā)針對人組織激肽釋放酶的試劑盒。 [目的]開發(fā)激肽釋放酶含量測定ELISA試劑盒,用于診斷缺血性腦卒中、冠心病、糖尿病等疾病。 [方法](1)以pcDNA-HK為模板,用特異性引物PCR擴(kuò)增KLK1目的基因,將鑒定結(jié)果為陽性的目的基因的重組質(zhì)粒HK/4T1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,進(jìn)行人組織激肽釋放酶融合蛋白(HK-4T1)的原核表達(dá)及純化,并且進(jìn)一步優(yōu)化條件。(2)單克隆抗體制備,以雜交瘤細(xì)胞注射小鼠,誘生腹水產(chǎn)生的單克隆抗體效價(jià)可到1：1×10∧5。用AKTA系統(tǒng)純化后能得到純度高、效價(jià)高的抗體,可用于ELISA檢測。(3)制備多克隆抗體用于KLK1試劑盒包被孔板,以提高試劑盒檢測的準(zhǔn)確性。同時(shí)用未包被的酶標(biāo)板做直接法ELISA實(shí)驗(yàn)。 [結(jié)果](1)將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳,與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品比較,在相對分子質(zhì)量55KDa處可見明顯的高表達(dá)帶。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明重組蛋白具有KK的抗原性。(2)相對于細(xì)胞培養(yǎng)基上清,小鼠腹水產(chǎn)生的單克隆抗體較易獲得純度高,效價(jià)高的抗體。(3)多抗包被的孔的OD值隨著抗原濃度的降低有下降趨勢,但線性關(guān)系較差；直接法的OD值在0.75ug/ml濃度以下的線性關(guān)系較好。 [結(jié)論]已經(jīng)成功克隆并表達(dá)人組織激肽釋放酶基因,在最佳條件下,初分離產(chǎn)品中,絕大部分比重為目的蛋白包涵體,對初產(chǎn)品的精細(xì)分離采用排阻色譜和親和色譜完成,以便進(jìn)一步提高目的蛋白的比重,已經(jīng)初步建立起對人組織激肽釋放酶的高效ELISA檢測試劑盒,為下一步進(jìn)行血漿激肽釋放酶含量的檢測做好鋪定,接下來的工作主要集中在將產(chǎn)品工業(yè)化及提高測試方法的精確度及可重復(fù)性上
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1221152