本文關(guān)鍵詞：惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原的免疫組學(xué)分析

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【摘要】：瘧疾屬于全球三大傳染病之一,給人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來重大影響。由于缺乏有效的瘧疾疫苗,全球每年死于瘧疾的人數(shù)超過120萬。其中惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)是主要的人類感染瘧原蟲蟲種,且死亡率較高。瘧原蟲生活史包含人和按蚊兩個(gè)宿主,在人體內(nèi)寄生于肝臟細(xì)胞和紅細(xì)胞,入侵紅細(xì)胞時(shí)期是主要的致病階段,因此紅細(xì)胞期裂殖子表面抗原與紅細(xì)胞的相互作用成為目前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。 本研究以惡性瘧原蟲紅內(nèi)期裂殖子表面蛋白為研究對象,通過對裂殖子蛋白的克隆表達(dá),篩選出有免疫反應(yīng)性的抗原,為今后抗原功能研究和抗體制備提供了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中采用高通量方法,如In-Fusion克隆、麥胚無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系和蛋白芯片技術(shù),快速高效分析裂殖子蛋白與人血清抗體的反應(yīng)情況,篩選出具有高免疫反應(yīng)的裂殖子表面抗原。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： (1)從瘧原蟲公共數(shù)據(jù)庫(PlasmoDB)中篩選出112個(gè)編碼惡性瘧原蟲裂殖子蛋白的基因,共有192個(gè)開放閱讀框(open reading frames, ORFs)片段,這些裂殖子蛋白具有以下四個(gè)特征：①裂殖子期特異性表達(dá)蛋白②惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞相關(guān)蛋白③含有信號肽蛋白④含有一個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)蛋白。 (2)PCR成功擴(kuò)增152個(gè)ORFs,通過In-Fusion克隆高效連接成功138個(gè)(90.8%)裂殖子ORFs,在克隆成功的97個(gè)基因(相當(dāng)于138個(gè)ORFs片段)中,其中79個(gè)基因含有信號肽,53個(gè)含有轉(zhuǎn)膜區(qū)。 (3)采用麥胚無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系合成惡性瘧原蟲裂殖子蛋白,通過western-blot分析其中42個(gè)蛋白,有37個(gè)成功表達(dá),且均為可溶性蛋白(100%,37/37)。 (4)采用蛋白芯片高通量分析惡性瘧原蟲裂殖子蛋白的表達(dá)水平(與Penta-His抗體反應(yīng)),85.5%(118/138)的惡性瘧原蟲裂殖子蛋白(帶有His6-tag的融合蛋白)被檢測出與抗體反應(yīng)呈現(xiàn)陽性,為表達(dá)成功的蛋白。 (5)基于蛋白芯片技術(shù)將惡性瘧原蟲裂殖子蛋白分別與16份惡性瘧原蟲感染的病人血清和16份正常人血清反應(yīng),共鑒定出30個(gè)具有高免疫反應(yīng)的裂殖子抗原(21.7%,30/138),其中有14個(gè)蛋白與超過50%(8/16)的病人血清有強(qiáng)烈反應(yīng)。頂端裂殖子蛋白Pf34和GPI錨定微線體抗原GAMA可與超過93.8%(15/16)的病人血清反應(yīng)。此外,有7個(gè)蛋白(MSP3.5, MRSP2, ETRAMP11.2, ETRAMP14.1, RALP1和2個(gè)假設(shè)蛋白PFA0210c,PF14_0572)是初次被鑒定有免疫反應(yīng)性。在惡性瘧原蟲裂殖子蛋白與病人血清及正常血清反應(yīng)的平均熒光信號強(qiáng)度中,有5個(gè)(Pf34, GAMA, MSP3.1, ETRAMP14.1, PF10_0138)裂殖子蛋白平均反應(yīng)信號強(qiáng)度高于4000,具有比較高的抗體敏感性。假設(shè)蛋白(PF10_0138)的平均信號強(qiáng)度超過7000,該蛋白可識別83.3%(10/12)的受惡性瘧原蟲感染的病人血清。 采用In-Fusion克隆、麥胚無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系和蛋白芯片技術(shù)等高通量篩選體系,結(jié)合生物信息學(xué)方法,分析鑒定了惡性瘧原蟲裂殖子免疫蛋白組。這些表面抗原可能與裂殖子入侵紅細(xì)胞的過程息息相關(guān),可作為潛在的瘧原蟲紅內(nèi)期疫苗候選分子。本研究為進(jìn)一步分析瘧原蟲裂殖子表面抗原的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 夏志貴;楊曼尼;周水森;;2011年全國瘧疾疫情分析[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2012年06期

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本文編號：1191717