本文關鍵詞：弓形蟲GRA7分泌蛋白與宿主組分的相互作用研究

  更多相關文章： 剛地弓形蟲 GRA7分泌蛋白 抗原性 蛋白互作 GST pull-down實驗 Co-IP實驗

【摘要】：目的：剛地弓形蟲RH株速殖子致密顆粒蛋白GRA7-GST-His融合蛋白的原核克隆表達，評價該蛋白的抗原性，研究弓形蟲GRA7分泌蛋白與宿主組分的相互作用，為今后研究弓形蟲感染免疫機理、弓形蟲的治療奠定基礎。 方法：在體外用Hela細胞系培養(yǎng)弓形蟲速殖子，利用梯度密度離心法和Percoll細胞分離液分離純化速殖子。提取弓形蟲總RNA，反轉錄獲得cDNA，PCR擴增GRA7基因全長，與pET-41Ek/LIC載體通過基因重組直接連接，在大腸桿菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中IPTG誘導表達重組融合蛋白，并用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱分離純化帶有His標簽的蛋白，采用SDS-PAGE和Western blotting鑒定重組蛋白產物。制備該純化蛋白的小鼠免疫血清，用人弓形蟲抗血清和小鼠免疫血清鑒定該蛋白的免疫原性。將THP-1細胞培養(yǎng)的弓形蟲速殖子刺激分化單核巨噬細胞（THP-1），收集細胞裂解液進行GST pull-down實驗，并將抓取的蛋白物質進行液相色譜和兩級質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）進行蛋白鑒定。將鑒定后的細胞蛋白碳酸酐酶CA進行克隆表達純化后制備小鼠免疫血清，用于Co-IP實驗驗證體內蛋白互作。在THP-1細胞系中瞬時轉染pcDNA3.1-CA質粒過表達碳酸酐酶CA，觀察碳酸酐酶CA對弓形蟲生長的影響。 結果：GRA7重組蛋白與人源弓形蟲患者血清、小鼠免疫血清免疫雜交表明克隆表達的GRA7蛋白抗原性較高。通過GST pull-down和Co-IP實驗證實弓形蟲GRA7分泌蛋白與宿主碳酸代謝酶類有顯著蛋白互作。過表達碳酸酐酶CA和對照組相比，，實驗組的弓形蟲速殖子的出蟲速度顯著提高，最終出蟲數(shù)量基本相同。 結論：大腸桿菌原核表達的弓形蟲GRA7蛋白具有較好的抗原性，可為弓形蟲臨床免疫診斷試劑制備提供依據(jù)。宿主細胞碳酸代謝酶類被弓形蟲GRA7分泌蛋白識別作用后直接或間接參與弓形蟲的細胞內繁殖過程，可能與納蟲泡的形成和穩(wěn)定性有關。
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R382.5

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 張居作;陳漢忠;徐君飛;;我國弓形蟲的感染現(xiàn)狀[J];動物醫(yī)學進展;2008年07期

2 李祥瑞;;弓形蟲病的流行的新趨勢[J];動物醫(yī)學進展;2010年S1期

3 彭碧文,林建銀;弓形蟲P24基因編碼蛋白的分子生物學研究進展[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);2004年03期

4 楊翠萍;萬紅嬌;宋賢響;;弓形蟲病治療的研究進展[J];時珍國醫(yī)國藥;2006年09期

5 尹志奎,楊錦楠,許兵紅,劉世國;弓形蟲GRA7基因在大腸埃希菌中的表達[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報;2005年02期

6 舒玉剛;張東祥;肖忠海;崔文玉;聶鴻靖;張延坤;張雁芳;程悅;汪海;;碳酸酐酶靶向性抑制劑甲苯磺烷唑胺對機體缺氧耐力的影響[J];中國應用生理學雜志;2011年03期

7 吳亮;陳盛霞;李琳婕;車飛虎;鄧紅艷;姜旭淦;;剛地弓形蟲RH株速殖子在HeLa細胞系體外培養(yǎng)的實驗觀察[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2008年06期

8 吳亮;章秋霞;李婷婷;陳盛霞;曹建平;;人包皮成纖維細胞和人子宮頸癌細胞體外培養(yǎng)弓形蟲速殖子[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2009年03期

9 宋春澤;周成合;袁勇;;磺胺類碳酸酐酶抑制劑研究進展[J];中國新藥雜志;2007年18期

本文編號：1178494