本文關(guān)鍵詞：弓形蟲GRA7分泌蛋白與宿主組分的相互作用研究

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【摘要】：目的：剛地弓形蟲RH株速殖子致密顆粒蛋白GRA7-GST-His融合蛋白的原核克隆表達(dá)，評價該蛋白的抗原性，研究弓形蟲GRA7分泌蛋白與宿主組分的相互作用，為今后研究弓形蟲感染免疫機(jī)理、弓形蟲的治療奠定基礎(chǔ)。 方法：在體外用Hela細(xì)胞系培養(yǎng)弓形蟲速殖子，利用梯度密度離心法和Percoll細(xì)胞分離液分離純化速殖子。提取弓形蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR擴(kuò)增GRA7基因全長，與pET-41Ek/LIC載體通過基因重組直接連接，在大腸桿菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，并用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱分離純化帶有His標(biāo)簽的蛋白，采用SDS-PAGE和Western blotting鑒定重組蛋白產(chǎn)物。制備該純化蛋白的小鼠免疫血清，用人弓形蟲抗血清和小鼠免疫血清鑒定該蛋白的免疫原性。將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)的弓形蟲速殖子刺激分化單核巨噬細(xì)胞（THP-1），收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行GST pull-down實驗，并將抓取的蛋白物質(zhì)進(jìn)行液相色譜和兩級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）進(jìn)行蛋白鑒定。將鑒定后的細(xì)胞蛋白碳酸酐酶CA進(jìn)行克隆表達(dá)純化后制備小鼠免疫血清，用于Co-IP實驗驗證體內(nèi)蛋白互作。在THP-1細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CA質(zhì)粒過表達(dá)碳酸酐酶CA，觀察碳酸酐酶CA對弓形蟲生長的影響。 結(jié)果：GRA7重組蛋白與人源弓形蟲患者血清、小鼠免疫血清免疫雜交表明克隆表達(dá)的GRA7蛋白抗原性較高。通過GST pull-down和Co-IP實驗證實弓形蟲GRA7分泌蛋白與宿主碳酸代謝酶類有顯著蛋白互作。過表達(dá)碳酸酐酶CA和對照組相比，，實驗組的弓形蟲速殖子的出蟲速度顯著提高，最終出蟲數(shù)量基本相同。 結(jié)論：大腸桿菌原核表達(dá)的弓形蟲GRA7蛋白具有較好的抗原性，可為弓形蟲臨床免疫診斷試劑制備提供依據(jù)。宿主細(xì)胞碳酸代謝酶類被弓形蟲GRA7分泌蛋白識別作用后直接或間接參與弓形蟲的細(xì)胞內(nèi)繁殖過程，可能與納蟲泡的形成和穩(wěn)定性有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R382.5

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本文編號：1178494