本文關(guān)鍵詞：MG-132對SY5Y細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147表達的影響

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【摘要】：目的：細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, CD 147)是種跨膜糖蛋白,能夠通過刺激成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬酶類(Matrix metalloproteinases, MMPs)的表達,促使腫瘤細(xì)胞周圍細(xì)胞外基底膜和間質(zhì)成分降解,從而有利于腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和擴散。隨著人們對CD147研究的進一步深入,發(fā)現(xiàn)其可在多種組織和細(xì)胞中表達,并且不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而且還可參與視黃醛功能、胚胎發(fā)育、胸腺T細(xì)胞發(fā)育以及其他正常生理過程。研究表明,MMP抑制劑對于治療腫瘤的成效不是十分理想,而以作用于MMP誘導(dǎo)劑的CD147為靶目標(biāo)的治療方式可能是一種有效的技術(shù)方法。該方法可通過抑制CD147的表達來抑制MMP的分泌及其活性,從而為與MMP相關(guān)疾病的治療提供新的方向策略。于是,如何調(diào)控、影響CD147的表達成為了有待于解決的問題關(guān)鍵。目前,對于CD147的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用蛋白等有了較為廣泛的了解,但對其表達調(diào)控、降解途徑的研究還沒有較為清晰的報道。生成與降解均可影響蛋白含量的水平。在真核細(xì)胞內(nèi),泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway, UPS)是一條主要的蛋白降解通路,介導(dǎo)的蛋白降解是機體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平與功能的一個重要機制,細(xì)胞內(nèi)約80%以上的蛋白均經(jīng)此途徑降解。在調(diào)整細(xì)胞周期、控制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用,成為治療腫瘤的靶點,如果通路出現(xiàn)異常則會導(dǎo)致疾病的發(fā)生,但CD147是否也與此降解途徑相關(guān)目前還不十分清楚。研究CD147的作用機制以及其信號傳導(dǎo)過程,以求探索阻斷其傳導(dǎo)或有效抑制其作用的有效方法,也許將能為我們提供一條有效的遏制惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病的新路徑。MG-132是種醛基肽類蛋白酶體抑制劑,是第一類被發(fā)現(xiàn)和廣泛應(yīng)用的蛋白酶體抑制劑,可以抑制20S催化顆粒中類糜蛋白酶活性,阻止蛋白酶體對泛素化蛋白的降解。因此,本實驗在此基礎(chǔ)上,利用蛋白酶體抑制劑MG-132對SY5Y細(xì)胞進行干預(yù),利用兩種不同的實驗方法westernblot和in-cell western分別檢測,觀察蛋白酶體抑制劑MG-132對CD147表達的影響,初步探討CD147的降解途徑,為尋找與CD147相關(guān)的腫瘤性疾病治療提供理論依據(jù)和方向策略。方法：1實驗材料人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y,90% DMEM,10%胎牛血清,37℃,5%CO2培養(yǎng),5-7天傳代。2 Westernblot接種于6孔板內(nèi),不同濃度蛋白酶抑制劑MG-132(0,1,2.5和5μmol/L)培養(yǎng)24 h后,RIPA裂解,經(jīng)超聲破碎4℃低溫離心,吸取上清,蛋白變性,；加入聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；加入檢測抗體CD147/GAPDH,4℃搖動過夜；漂洗后加入熒光二抗孵育；Odyssey雙色紅外激光成像儀掃描,以儀器自帶軟件對各孔吸光度值進行測量。3 In-cell western接種于96孔板內(nèi),不同濃度蛋白酶抑制劑MG-132(0,1,2.5和5μmol/L)培養(yǎng)24 h后Odyssey雙色紅外激光成像儀掃描,以儀器自帶軟件對各孔吸光度值進行測量。4免疫雙標(biāo)染色觀察24孔板培養(yǎng)SY5Y細(xì)胞48h,4%多聚甲醛固定0.5h。PBS充分清洗后山羊血清封閉2h。加入CD147一抗和ubiquitin一抗共孵育過夜,第二天清洗后分別加入熒光二抗Dylight 488/Dylight 594,利用奧林巴斯全能顯微鏡觀察二者在細(xì)胞中的分布及定位情況。結(jié)果：1 Westernblot檢測,在一定時間內(nèi),隨著MG-132濃度的增大,CD147的含量相對增多；與0μmol/L組比較,5μmol/L組的CD147含量增加了約151.81±36.26%(P0.05)。2 In-cell western檢測,在一定時間內(nèi),隨著MG-132濃度的增大,CD147的含量相對增多；與0μmol/L組比較,5μmol/L組的CD147含量增加了約76.43±18.02%(P0.05)；3 CD147與ubiquitin在胞體中存在共定位的特征。結(jié)論：1蛋白酶體抑制劑MG-132可影響CD147的表達,呈正相關(guān)性。2推測MG-132可能通過抑制CD147的降解來增加其表達含量。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 宋長征;;泛素-蛋白酶體通路的轉(zhuǎn)化研究進展[J];濟南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2013年03期

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本文編號：1176784